王明慧，閆佳，韓永斌，顧振新

1(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部農(nóng)畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京，210095)

2(南京市鼓樓區(qū)衛(wèi)生監(jiān)督所，江蘇南京，210009)

糯米藕是以新鮮蓮藕為原料，揣入混有糖液的糯米，經(jīng)高溫煮制等工序制成的，是我國(guó)傳統(tǒng)的蓮藕制品之一，香甜可口、食用方便且營(yíng)養(yǎng)衛(wèi)生，深受消費(fèi)者喜愛(ài)［1］。類黑精是糯米藕在加工過(guò)程中還原糖與氨基化合物發(fā)生美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的伴有芳香氣味的紅褐色物質(zhì)［2－3］，是不同種類高分子量化合物組成的水溶性復(fù)雜混合物［4］。研究發(fā)現(xiàn)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有良好的抗氧化活性［5－8］，是一種天然的抗氧化劑，并賦予食品芳香風(fēng)味，此外，還具有抗突變、誘變等功能［9－10］，其在人體內(nèi)經(jīng)酶活化，可能具有較強(qiáng)吸附病毒、細(xì)菌和人體內(nèi)代謝產(chǎn)物作用，可調(diào)整機(jī)體內(nèi)環(huán)境紊亂［11－12］;類黑精具有類似膳食纖維的功能，可降低人體餐后血糖等［13］。目前較多的研究集中在果蔬制品美拉德反應(yīng)產(chǎn)物提?。?4－17］和體外美拉德反應(yīng)產(chǎn)物定性定量制備研究其結(jié)構(gòu)及抗氧化活性方面［18－21］。對(duì)糯米藕制品的研究主要集中在其加工過(guò)程中褐變控制方面［1，22－23］，尚未見(jiàn)對(duì)糯米藕中美拉德反應(yīng)產(chǎn)物類黑精的抗氧化活性研究。本研究在對(duì)糯米藕類黑精提取方法優(yōu)化的基礎(chǔ)上，研究了其類黑精抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

糯米藕:11月份生產(chǎn)，真空包裝，江蘇省揚(yáng)州花扇蔬菜食品有限公司提供;無(wú)水乙醇(分析純)，南京化學(xué)試劑有限公司;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼 (1，1-Diphenyl-2-picrylhydraztl)(分析純)，上海伊卡生物技術(shù)有限公司;K3Fe(CN)6(分析純)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;三氯乙酸(分析純)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;FeCl3(分析純)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;FeSO4(分析純)，西隴化工股份有限公司;水楊酸(分析純)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;H2O2純?cè)噭?，南京化學(xué)試劑有限公司;去離子水等。

JA2003型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司;HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國(guó)華電器有限公司;TDL-40B離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠;UV-2802型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，尤尼柯(上海)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 糯米藕類黑精提取工藝

1.2.1.1 提取溶劑濃度的選擇

準(zhǔn)確稱取2.5 g糯米藕(去除糯米部分，下同)樣品9份，按料液比1∶30分別加入0%(蒸餾水)、10%、20%、30%、45%、60%、70%、85%、100% 乙醇水溶液各50 mL，于室溫 (20℃)研磨均勻后浸提2 h，12 000 r/min離心15 min，取上清液于420 nm處比色，以吸光值A(chǔ)反應(yīng)糯米藕中提取的類黑精含量，其中，A值與類黑精量呈正相關(guān)性［7］。

1.2.1.2 料液比的選擇

準(zhǔn)確稱取2.5 g糯米藕樣品6 份，按 1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 料液比分別加入體積分?jǐn)?shù) 10%乙醇水溶液，室溫研磨均勻后浸提2 h，12 000 r/min離心15 min，取上清液于420 nm處比色，測(cè)定吸光值A(chǔ)。

類黑精量(AV值)=A(吸光度值)×V(相對(duì)體積比倍數(shù))［15］。

1.2.1.3 提取時(shí)間的選擇

準(zhǔn)確稱取2.5 g糯米藕樣品8份，按1∶30料液比分別加入體積分?jǐn)?shù)10%乙醇水溶液，室溫研磨均勻后分別浸提 0、0.5、1、2、4、6、9、12 h，12 000 r/min離心15 min，取上清液于420 nm處比色，測(cè)定吸光值A(chǔ)。

1.2.1.4 提取溫度的選擇

準(zhǔn)確稱取2.5 g糯米藕樣品7份，按1∶30料液比分別加入體積分?jǐn)?shù)10%乙醇水溶液，室溫研磨均勻后，分別于 20、40、60、70、80、90、100 ℃下浸提 2 h，取出后立即用冷水冷卻至室溫，12 000 r/min離心15 min，取上清液于420 nm處比色，測(cè)定吸光值A(chǔ)。

1.2.1.5 提取工藝參數(shù)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素的基礎(chǔ)上，以420 nm處吸光度A值和AV值為指標(biāo)，選取對(duì)糯米藕類黑精的提取率影響較顯著的乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間、提取溫度4個(gè)因素進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，直觀分析確定糯米藕類黑精提取的最佳工藝條件。正交實(shí)驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。

表1 L9(34)正交試驗(yàn)因素水平Table 1 The factors and levels of L9(34)orthogonal design

1.2.2 糯米藕類黑精的抗氧化活性

1.2.2.1 樣品預(yù)處理

準(zhǔn)確稱取2.5 g糯米藕樣品，按1∶40料液比加入體積分?jǐn)?shù)10%乙醇研磨均勻，80℃水浴浸提1.5 h，取出后立即用冷水冷卻，12 000 r/min下離心15 min，取上清液待用。以類黑精提取原液的濃度為1.0，分別稀釋成 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 倍，測(cè)定不同濃度類黑精的抗氧化活性指標(biāo)。

1.2.2.2 糯米藕類黑精清除DPPH·活性

取不同濃度樣品溶液1.0 mL于試管中，分別加入0.3 mL 0.4 mmol/L DPPH無(wú)水乙醇溶液，再加入2.0 mL蒸餾水，混勻后常溫避光反應(yīng)30 min，于紫外分光光度計(jì)517 nm處測(cè)定其吸光值，為A1;以蒸餾水代替樣品溶液測(cè)定的吸光值為A0;無(wú)水乙醇代替DPPH·溶液測(cè)定的吸光值為A2;以蒸餾水代替樣品溶液、無(wú)水乙醇代替DPPH溶液，作空白實(shí)驗(yàn)調(diào)零，清除率由以下公式得出［25］:

清除率/%=［A0－(A1－A2)］/A0×100

1.2.2.3 糯米藕類黑精的還原力

取不同濃度樣品溶液1.0 mL于離心管中，分別加入2.5 mL 0.2 mol/L pH 6.6磷酸緩沖液、2.5 mL 10 g/L K3Fe(CN)6溶液，混勻后置于50℃水浴中反應(yīng)20 min，取出后立即用冷水冷卻，并加入2.5 mL 100 g/L三氯乙酸溶液，混勻后于3 000 r/min離心10 min。取2.5 mL上清液，加入2.5 mL蒸餾水和1 mL 1 g/L FeCl3溶液，混勻靜置10 min，700 nm處測(cè)定其吸光值(A樣品)，以蒸餾水代替樣品溶液作空白對(duì)照(A對(duì)照)，還原力由以下公式得出［25］:

還原力/%=(A樣品－A對(duì)照)×100

1.2.2.4 類黑精的羥基自由基清除能力［24，26］

取5 支試管，依次為 1、2、3、4、5，分別加入 1 mL 9 mmol/L FeSO4溶液和2 mL 9 mmol/L水楊酸乙醇溶液，按不同編號(hào)依次加入2 mL不同濃度樣品溶液，和2 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液，室溫下反應(yīng)1 h后于510 nm處測(cè)定其吸光值A(chǔ)S，以蒸餾水代替樣品溶液作空白A0，以蒸餾水調(diào)零，清除率由以下公式得出:

清除率/%=(A0－AS)/A0×100

1.2.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果采用 Excel和 Sigmaplot10.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和圖形處理，SPSS20.0軟件進(jìn)行顯著性分析 (P＜0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 糯米藕類黑精提取工藝單因素及正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)糯米藕類黑精提取率的影響

由圖1可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，糯米藕類黑精的提取量(AV420值)呈現(xiàn)先增加后逐漸降低的趨勢(shì)。乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%時(shí)提取量達(dá)到最大，OD420值為0.17;隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)進(jìn)一步增加，類黑精的提取量顯著下降(P＜0.05)，并在乙醇體積分?jǐn)?shù)為100%時(shí)達(dá)到最小，OD420值為0.03。體積分?jǐn)?shù)10%的乙醇提取的類黑精量顯著高于其他乙醇體積分?jǐn)?shù)(P＜0.05)，但與對(duì)照(蒸餾水)無(wú)顯著差異(P＞0.05)。有研究指出，乙醇溶液有助于沉淀一些水溶性蛋白［15］，且醇溶液中的類黑精比水溶液中更穩(wěn)定［7］。因此，本試驗(yàn)選取浸提劑為體積分?jǐn)?shù)10%的乙醇水溶液。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)糯米藕類黑精提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction of Melanoidin in Lotus root filled with sticky rice

2.1.2 料液比對(duì)糯米藕類黑精提取率的影響

隨著料液比增加，糯米藕類黑精提取量呈先迅速增加后趨于穩(wěn)定再下降的趨勢(shì)。料液比為1∶30時(shí)，類黑精提取AV值為3.22，提取量達(dá)到最大，其中1∶30與1∶10、1∶20 間無(wú)顯著差異(P ＞0.05)(圖2)。這可能由于一定范圍內(nèi)增加提取溶劑量有助于提高溶劑擴(kuò)散率和傳質(zhì)速率，但溶劑量過(guò)大會(huì)導(dǎo)致提取完全所需時(shí)間相應(yīng)延長(zhǎng)，且浸出的類黑精對(duì)未浸出產(chǎn)物有一定抑制作用［27，28］。因此選擇料液比為 1∶10～1∶30可達(dá)到良好的提取效果。

圖2 料液比對(duì)糯米藕類黑精提取提取率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the extraction of Melanoidin in Lotus root filled with sticky rice

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)糯米藕類黑精提取率的影響

如圖3所示，提取時(shí)間1 h內(nèi)，類黑精提取量顯著增加(P＜0.05)，在1 h時(shí)達(dá)到最大，OD420值為0.11;當(dāng)提取時(shí)間在1～4 h時(shí)，提取量無(wú)顯著性差異(P＞0.05);提取時(shí)間為4～6 h時(shí)類黑精提取量明顯下降(P＜0.05)，12 h后達(dá)到最低，OD420值為0.08?？赡茉蚴请S著時(shí)間的延長(zhǎng)，浸提出的雜質(zhì)量增多，有效成分含量下降，也可能是溶劑揮發(fā)引起溶劑濃度下降，導(dǎo)致提取率降低［27］。

圖3 提取時(shí)間對(duì)糯米藕類黑精提取率的影響Fig.3 Effect of time on the extraction of Melanoidin in Lotus root filled with sticky rice

2.1.4 提取溫度對(duì)糯米藕類黑精提取率的影響

如圖4所示，隨著提取溫度的升高，糯米藕類黑精提取量顯著增加，至90℃達(dá)到最高，OD420值為0.44，當(dāng)提取溫度為100℃時(shí)，提取量卻顯著降低(P＜0.05)，OD420值為0.26?？赡苁怯捎跍囟壬?，有助于促進(jìn)產(chǎn)物中可溶性成分的溶解和擴(kuò)散速度，但溫度過(guò)高，容易破壞類黑精的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致分解、變質(zhì)或揮發(fā)散失［27，29－30］。

圖4 提取溫度對(duì)糯米藕類黑精提取率的影響Fig.4 Effect of temperature on the extraction of Melanoidin in Lotus root filled with sticky rice

2.1.5 正交試驗(yàn)結(jié)果

由單因素實(shí)驗(yàn)可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間、提取溫度均會(huì)影響糯米藕中類黑精提取效果。因此，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取以上四因素進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)優(yōu)化(表2)和結(jié)果的方差分析(表3)。

由表2、表3可知，各因素對(duì)糯米藕類黑精提取效果的影響主次順序依次為:D＞A＞C＞B，即提取溫度對(duì)糯米藕類黑精提取效果影響最大，其次為乙醇濃度、提取時(shí)間，料液比對(duì)糯米藕類黑精提取效果影響最小，其中，A、C、D對(duì)糯米藕類黑精提取效果影響顯著，最佳水平組合為A2B3C3D3，即提取溶劑選取體積分?jǐn)?shù)10%乙醇，按料液比1∶40(g∶mL)研磨均勻，提取溫度為80℃，提取時(shí)間為1.5 h。按最佳條件進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，測(cè)得糯米藕類黑精提取AV值為8.235，此結(jié)果高于正交試驗(yàn)中任意組合的產(chǎn)物提取量，說(shuō)明正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠，提取工藝可行。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of orthogonal experiment

表3 方差分析結(jié)果Table 3 The results of analysis of variance

2.2 糯米藕類黑精的抗氧化活性

2.2.1 糯米藕類黑精的DPPH.清除能力

由圖5可知，糯米藕類黑精提取液具有DPPH·清除能力，且隨著產(chǎn)物濃度的增加其清除能力增強(qiáng)。當(dāng)其相對(duì)濃度為0.2時(shí)，類黑精提取液的DPPH·清除能力為40.24%，到相對(duì)濃度為0.4時(shí)，顯著增加(P＜0.05)到44.72%;在相對(duì)濃度0.4～0.8范圍內(nèi)，DPPH·清除能力無(wú)顯著增加趨勢(shì)(P＞0.05)，但當(dāng)類黑精提取液相對(duì)濃度到1.0時(shí)，其DPPH·清除能力迅速增加，并達(dá)到最強(qiáng)，為53.39%，顯著高于其他濃度(P＜0.05)。說(shuō)明糯米藕中類黑精具有較強(qiáng)的抗氧化活性，并隨濃度的增大而增強(qiáng)。

圖5 不同濃度糯米藕類黑精的DPPH·清除能力Fig.5 DPPH radical scavenging activity of Melanoidin with different concentration in Lotus root filled with sticky rice

2.2.2 糯米藕類黑精的還原能力

還原力與抗氧化性密切相關(guān)，還原力大的原料是良好的電子供體，使Fe3+還原成Fe2+，并能與自由基結(jié)合成較穩(wěn)定物質(zhì)，中斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)［31－32］。由圖6可見(jiàn)，糯米藕類黑精提取液具有顯著的還原力(P＜0.05)，并隨著濃度的增加而增強(qiáng)。當(dāng)其相對(duì)濃度為0.2時(shí)，類黑精提取液的還原力為4.05%，隨著濃度增大，其還原力逐漸增大，并在濃度為1.0時(shí)達(dá)到最大值，為15.95%，分析得到糯米藕類黑精濃度與其還原能力具有良好的線性關(guān)系，表達(dá)式為:y=0.147 5 x+0.013，R2=0.998 7。表明糯米藕類黑精的還原能力與其濃度間具有良好的線性關(guān)系，并隨濃度增加而增強(qiáng)。

圖6 不同濃度下糯米藕類黑精的還原能力Fig.6 Reducing power of Melanoidin with different concentration in Lotus root filled with sticky rice

2.2.3 糯米藕類黑精的羥基自由基清除能力

羥基自由基(·OH)清除率能有效反應(yīng)物質(zhì)的抗氧化性，·OH的氧原子上含有一個(gè)未配對(duì)電子，奪取電子能力很強(qiáng)，在過(guò)渡金屬離子催化作用下，過(guò)氧化氫可發(fā)生均裂產(chǎn)生羥自由基［32－33］。如圖7所示，糯米藕類黑精提取液具有·OH清除能力，并隨著提取液濃度的增加而增強(qiáng)。在產(chǎn)物提取液相對(duì)濃度為0.2和0.4時(shí)，其羥基自由基清除能力不強(qiáng)，分別為0.94%和1.39%，但仍具有一定的清除能力(P＞0.05)。隨著類黑精濃度進(jìn)一步增加，其羥基自由基清除能力增加顯著(P＜0.05)，至相對(duì)濃度為1.0時(shí)，其羥基自由基清除能力達(dá)到10.16%。表明糯米藕中類黑精具有一定的抗氧化性，并隨著濃度的增大而增強(qiáng)。

圖7 不同濃度下糯米藕類黑精的羥自由基清除能力Fig.7 Hydroxyl radical scavenging capacity of Melanoidin with different concentration in Lotus root filled with sticky rice

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，糯米藕中類黑精提取的最佳工藝條件為:提取溶劑體積分?jǐn)?shù)10%乙醇，料液比1∶40(g∶mL)，浸提溫度80℃，浸提時(shí)間1.5 h，按此最佳條件進(jìn)行糯米藕類黑精提取，得類黑精提取AV值為8.235，此結(jié)果高于正交試驗(yàn)中任意組合的提取量，說(shuō)明該提取工藝可行。

糯米藕類黑精具有1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH·)清除能力、還原力及羥基自由基(·OH)清除能力，并與濃度呈顯著正相關(guān)，相對(duì)濃度為1.0(提取原液)時(shí)，還原力為15.95%，DPPH·清除能力為53.39%，·OH清除能力為10.16%。表明糯米藕中類黑精具有較強(qiáng)的抗氧化能力。

糯米藕中的類黑精是食品加工和貯藏過(guò)程中自身產(chǎn)生的，并賦予食品良好風(fēng)味，其抗氧化能力較強(qiáng)，是一種天然的抗氧化劑。糯米藕類黑精結(jié)構(gòu)及其他生物活性，以及糯米藕儲(chǔ)藏期與其類黑精含量、結(jié)構(gòu)的關(guān)系，有待進(jìn)一步研究。

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