裴陽晴，劉素娜，暴 磊，張紅義，侯建永，郝長付，姚 武

(1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 檢驗科 河南 鄭州 450052;2.鄭州大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院 河南 鄭州450001)

目前世界各國對塵肺病進行了大量的研究，但塵肺病的發(fā)病機制仍然不十分明確［1-2］。近年來的研究表明，塵肺病肺纖維化發(fā)生發(fā)展的過程與機體免疫功能變化密切相關(guān)。塵肺患者的免疫系統(tǒng)能夠感知自身細胞蛋白或多肽的異常表達，并使機體形成相應(yīng)的自身抗體，這些自身抗體是與塵肺病發(fā)生相關(guān)的分子事件的感知者和應(yīng)答者，是一種潛在的診斷塵肺病的生物標(biāo)記物。課題組的前期研究應(yīng)用抗體庫技術(shù)成功篩選出人源塵肺病的6 種強陽性克隆抗體［3-4］，其中發(fā)現(xiàn)顆粒酶B(Granzyme B，GzmB)抗體在塵肺病的發(fā)生發(fā)展過程中具有一定作用。

此次研究采用人群流行病學(xué)調(diào)查研究，對煤工塵肺患者及接塵工人血清中GzmB 抗體的表達水平進行檢測，探討其與塵肺病的關(guān)系。

1 調(diào)查對象和方法

1.1 調(diào)查對象 選擇調(diào)查對象1 260例，分為4 組，其中:觀察對象組230例，為河南省診斷X 射線胸片已出現(xiàn)塵肺病變但尚未達到壹期塵肺的男性煤礦工人;接塵組309例，為同地區(qū)相同工作環(huán)境中正在接塵但X 射線胸片尚未出現(xiàn)塵肺病變表現(xiàn)的男性煤礦工人;病例組328例，為根據(jù)現(xiàn)行塵肺病X 線診斷標(biāo)準(GBZ70-2009)確診為煤工塵肺患者的同地區(qū)男性煤礦工人;健康對照組393例，為河南省某醫(yī)院的男性健康體檢者。所有研究對象均接受問卷調(diào)查，且均排除自身免疫病及其他肺部疾病。

1.2 研究方法 采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbent serologic assay，ELISA)法檢測所有調(diào)查對象血清中GzmB 抗體的表達水平。

1.3 統(tǒng)計方法 采用Excel 建立數(shù)據(jù)庫，應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)庫進行統(tǒng)計分析，所有結(jié)果以(±s)表示，采用方差分析或t 檢驗，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 調(diào)查對象基本情況 調(diào)查對象共1 260例，其中觀察對象組、煤工塵肺患組、接塵組和健康對照組分別有230例、328例、309例和393例)。調(diào)查對象的工齡、吸煙及飲酒史差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)。見表1。

表1 調(diào)查對象的基本情況

2.2 調(diào)查對象血清中GzmB 抗體的水平比較 由表2可見，煤工塵肺患者血清中GzmB 抗體表達水平高于接塵組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05);煤工塵肺組血清中GzmB 抗體表達水平與對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。

2.3 煤工塵肺組內(nèi)不同期別人群血清中GzmB 抗體表達水平的比較 3 組人員血清中GzmB 的表達水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。見表3。

表2 調(diào)查對象血清中GzmB 抗體表達水平的比較(±s)

表2 調(diào)查對象血清中GzmB 抗體表達水平的比較(±s)

注:與煤工塵肺比較* P ＜0.05。

分期 n OD值230 1.416±0.450煤工塵肺組 328 1.478±0.450接塵組 309 1.325±0.463*對照組 393 1.377±0.430*F 6.661 P觀察對象組＜0.001

2.4 工齡對觀察對象、煤工塵肺組不同期別GzmB抗體表達的影響 由于叁期塵肺病例數(shù)太少，故將貳期塵肺與叁期塵肺合并成為一組。將工種分為3 組，工齡按照中位數(shù)25年分為兩組。對不同工齡的塵肺患者比較時發(fā)現(xiàn)，壹期塵肺組中，＜25年血清中GzmB抗體的表達低于≥25年組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。在工齡≥25年組中，觀察對象組血清中GzmB抗體的表達低于壹期塵肺組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。見表4。

表3 煤工塵肺組中不同期別人群血清GzmB 抗體表達水平(±s)

表3 煤工塵肺組中不同期別人群血清GzmB 抗體表達水平(±s)

分期 n OD值259 1.488± 0.451貳期塵肺 60 1.459± 0.446叁期塵肺 9 1.311± 0.423 F 0.739 P壹期塵肺0.478

表4 不同工齡血清GzmB 抗體表達水平的比較(±s)

表4 不同工齡血清GzmB 抗體表達水平的比較(±s)

注:與觀察對象組中工齡＞25年組比較* P ＜0.05，與壹期塵肺組中工齡＜25年組比較P ＜0.05。

工齡觀察對象組n OD 值壹期塵肺組n OD 值貳期和叁期塵肺組n OD 值F P 42 0.072 0.930≥25年 92 1.380±0.432 157 1.534±0.443* 36 1.458±0.449 3.589 0.029 t 0.993－2.026 0.357 P＜25年 138 1.440±0.461 102 1.418±0.457 33 1.420±0.4 0.322 0.044 0.722

3 討論

GzmB 是自然殺傷細胞和細胞毒性T 淋巴細胞所分泌的，進入靶細胞后引起caspases 的鏈鎖反應(yīng)［5］，致使靶細胞DNA 的降解，從而介導(dǎo)細胞凋亡，GzmB 可通過3 種途徑介導(dǎo)細胞凋亡，并且是其中重要的效應(yīng)分子［6］。在肺纖維化發(fā)生時，成纖維細胞中α-SMA、ColⅠ和ColⅢ蛋白含量的增加，提示成纖維細胞正在向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化，是纖維化發(fā)生的標(biāo)志之一［7-8］。有研究［9］通過建立GzmB 抗體抑制大鼠矽肺模型，發(fā)現(xiàn)抑制組α-SMA、ColⅠ和ColⅢmRNA 和蛋白的表達水平顯著高于空白組和二氧化硅處理組，提示抑制大鼠肺成纖維細胞GzmB 抗體，對二氧化硅致成纖維細胞激活具有抑制作用。

該研究通過ELISA 技術(shù)檢測觀察對象、煤工塵肺患者、接塵工人以及健康人群血清中GzmB 抗體的表達。結(jié)果顯示，對照組人群與接塵工人血清中GzmB抗體的表達水平均低于煤工塵肺患者，并且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，且對照組、觀察對象組和煤工塵肺組人群血清GzmB 抗體的表達逐漸增加。分析原因可能是由于在煤工塵肺的發(fā)生過程中，CTL 通過穿孔素/顆粒酶途徑作用于吞噬粉塵顆?；蛘弑环蹓m顆粒破壞的淋巴細胞、巨噬細胞及上皮細胞，并引起這些細胞DNA 降解，同時釋放Fas 配體和炎癥細胞因子，這些可溶性效應(yīng)分子的釋放能夠激活中性粒細胞和淋巴細胞，誘導(dǎo)T 細胞活化增殖，參與機體的免疫反應(yīng)，但也會破壞正常的肺巨噬細胞和上皮細胞并引起非特異性的淋巴細胞浸潤肺組織。這些非特異的炎癥細胞能加重CTL誘導(dǎo)的組織損傷并最終并加重纖維化反應(yīng)。有研究通過建立穿孔素基因敲除小鼠肺纖維化模型，發(fā)現(xiàn)穿孔素基因敲除小鼠肺組織細胞凋亡數(shù)量明顯少于野生型小鼠，說明穿孔素和GzmB 介導(dǎo)的凋亡反應(yīng)與肺纖維化有一定聯(lián)系［10］。此外張彬等［11］檢測IL-2、IL-12 對NK-92 細胞系表達顆粒酶基因的影響發(fā)現(xiàn)IL-2、IL-12等Th1 型細胞因子可以上調(diào)NK-92 細胞中GzmB 基因轉(zhuǎn)錄水平，而在煤工塵肺病早期，矽塵進入肺內(nèi)損傷和激活淋巴細胞、巨噬細胞等效應(yīng)細胞，分泌大量的Th1型細胞因子，這都與研究發(fā)現(xiàn)相一致。

在對不同期別煤工塵肺患者血清中GzmB 抗體的表達分析時發(fā)現(xiàn)，雖然不同期別之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但患者血清中GzmB 抗體的表達隨塵肺分期的增高有降低的趨勢，推測可能與肺組織纖維化的嚴重程度有關(guān)。隨著煤工塵肺的發(fā)生發(fā)展，當(dāng)Th1 型細胞因子占劣勢，Th2 型細胞因子占優(yōu)勢時，由于Th1 型細胞因子減少降低了顆粒酶B 的基因轉(zhuǎn)錄水平。同時由于肺組織纖維化的加重，細胞毒性T 細胞作用于肺正常細胞導(dǎo)致組織損傷的機制被抑制，因此患者血清中GzmB 抗體的表達逐漸減少。

在對工齡研究時發(fā)現(xiàn)粉塵接觸史長的患者血清中GzmB 抗體的表達水平高于接觸史較短的患者，差別有統(tǒng)計學(xué)意義。提示在煤工塵肺中，隨著接塵時間的增加，GzmB 大量釋放，導(dǎo)致淋巴細胞、巨噬細胞等效用細胞凋亡，加重肺纖維化，因此產(chǎn)生大量GzmB 抗體以抑制肺纖維化。

綜上所述，煤工塵肺患者血清中GzmB 抗體表達水平增高且與接塵工齡正相關(guān)，提示GzmB 抗體可能通過參與了煤工塵肺的發(fā)生發(fā)展過程，具體機制需進一步驗證。

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