鄭宇杰 湯華軍 范光碧 楊朝鮮

研究表明將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）移植入腦出血大鼠，BMSCs能存活、遷徙、分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，減少損傷體積，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)[1-2]。臨床實(shí)踐與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明電針對腦出血運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)具有明顯促進(jìn)作用[3]，但對其機(jī)制的研究還不夠深入。髓鞘堿性蛋白（Myelin basic protein，MBP）是構(gòu)成中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘的一種堿性蛋白，神經(jīng)組織損傷時(shí)髓鞘崩解，MBP從神經(jīng)纖維髓鞘上脫落，MBP含量較正常生理狀態(tài)下急劇增高，其血清含量的增高是急性腦實(shí)質(zhì)損傷和脫髓鞘改變的特異性生化指標(biāo)[4]。本研究旨在探討電針聯(lián)合BMSCs移植治療對腦出血大鼠血清MBP表達(dá)的影響，為電針聯(lián)合BMSCs移植治療腦出血的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑與儀器 成年SD雄性大鼠110只，體質(zhì)量200～300 g，由瀘州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；Rat Mesenchymal Stem cell購自賽業(yè)生物科技有限公司；肝素鈉注射液購自上海市醫(yī)藥股份有限公司；I型膠原酶購自Sigma公司；α-MEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；MBP抗體，MBP酶標(biāo)抗體，SABGCy3購自武漢博士德；HM 6805-Ⅱ型經(jīng)穴治療儀購自四川恒明科技開發(fā)有限公司；Multiskan MK3全自動(dòng)酶標(biāo)儀購自博奧通科科技（北京）有限公司。

1.2 大鼠腦出血?jiǎng)游锬Ｐ椭苽?用5 μL微量注射器抽取2 U/μL的肝素鈉1 μL和0.125 U/μL的膠原酶2 μL，然后固定在立體定位儀上。實(shí)驗(yàn)大鼠用1%戊巴比妥鈉按40 mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行腹腔注射麻醉；然后固定于立體定位儀上，作顱頂中線切口12 mm，用30%H2O2腐蝕暴露前囟及冠狀縫，以前囟為基點(diǎn)，向前0.2 mm，向右3 mm，開顱鉆鉆孔至硬腦膜，沿鉆孔進(jìn)針6 mm，將肝素鈉和膠原酶溶液緩慢注入尾殼核內(nèi)，留針5 min，緩慢退針，速度為1 mm/min，骨蠟封閉鉆孔，消毒縫合切口。

1.3 BMSCs復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代及誘導(dǎo) 在超凈工作臺內(nèi)打開凍存管，將解凍后的細(xì)胞轉(zhuǎn)入離心管中加入10倍體積的改良型α-MEM培養(yǎng)基，吸管輕吹均勻。1000 rpm離心4 min。棄上清，加入含15%胎牛血清的的α-MEM培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞密度以5×105/mL[5]。轉(zhuǎn)入25 mm2培養(yǎng)瓶置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長鋪滿培養(yǎng)瓶壁75%～80%左右時(shí)傳代。細(xì)胞移植前，將貼壁達(dá)80%融合BMSCs的培養(yǎng)基，更換為預(yù)誘導(dǎo)液培養(yǎng)24 h，再更換為誘導(dǎo)液誘導(dǎo)6 h后，收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度以2.5×107/mL，置于培養(yǎng)基中備用。

1.4 BMSCs移植及電針治療 在造模成功后第3天，用腦立體定位儀進(jìn)行固定，取細(xì)胞懸液20 μL沿造?？拙徛⑷胛矚ず?，速度為5 μL/min，留針5 min，緩慢退針，骨蠟封閉鉆孔，消毒縫合切口。在造模成功后第3天，對大鼠捆綁固定，參照林文注等[6]編著的《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》，應(yīng)用30號l寸毫針，選取百會穴及大椎穴進(jìn)針，毫針接HM 6805-Ⅱ型經(jīng)穴治療儀，頻率3 Hz，強(qiáng)度1 V，連續(xù)波，持續(xù)10 min，1次/d，直至取材時(shí)間點(diǎn)。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)設(shè)對照組和實(shí)驗(yàn)組。正常對照組（Normal組）5只，不做任何處理；假手術(shù)組（FO組）5只，造模和移植都同步麻醉和進(jìn)針但不注入任何藥物。將NSS評分≥9分的模型大鼠隨機(jī)分為4個(gè)實(shí)驗(yàn)組：生理鹽水組（NS組）；電針組（Ea組）；BMSCs移植組（BMSCs組）；電針聯(lián)合BMSCs移植組（Ea BMSCs組），每組25只，按照取材時(shí)間（1、3、5、7、14 d）不同分為5個(gè)亞組，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)5只。NS組大鼠注射20 μL生理鹽水，BMSCs組大鼠注射20 μL細(xì)胞懸液，Ea BMSCs組大鼠注射20 μL細(xì)胞懸液后再進(jìn)行電針刺激，Ea組只進(jìn)行電針治療不移植。

1.6 標(biāo)本采集 在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)麻醉大鼠，剪開胸腔，用采血針刺入左心室采血3～5 mL，用不抗凝專用試管收集標(biāo)注，4 ℃靜置30 min后，4000 r冷凍離心10 min，取血清分裝標(biāo)注，-80 ℃冰箱保存待檢。

1.7 血清MBP檢測 用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測。將預(yù)包被MBP抗體的酶標(biāo)板、試劑等平衡至室溫，分別在相應(yīng)孔內(nèi)加入待檢血清、陰性對照、陽性對照。每孔滴加酶標(biāo)抗體，置37 ℃溫育60 min。室溫平衡5 min，甩干孔內(nèi)液體，用洗液洗滌5次，扣干。每孔加顯色劑，輕拍混勻。酶標(biāo)儀測定OD值，用空白調(diào)零。樣品OD值/臨界值≥1為陽性，樣品OD值/臨界值<1為陰性，陰性對照OD值≥0.1時(shí)，重復(fù)試驗(yàn)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，所有數(shù)據(jù)以（±s）表示，單因素方差分析組內(nèi)差異，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析組間差異，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

各組MBP第1天表達(dá)最高，隨即下降第3天達(dá)谷底，隨后快速上升第7天達(dá)到波峰后下降。與NS組比較：Ea組第5、7、14天MBP表達(dá)低于NS組（P<0.05）；BMSCs組MBP 表達(dá)第 14天低于 NS組（P<0.05）；Ea BMSCs組第 5、7、14天MBP表達(dá)顯著低于NS組（P<0.01）。與Ea BMSCs組比較：Ea組第1、3天MBP表達(dá)低于Ea BMSCs組（P<0.05），第14天高于Ea BMSCs組（P<0.05）；BMSCs組MBP表達(dá)第5、7、14天高于Ea BMSCs組（P<0.05）；腦出血各治療組14天時(shí)仍高于FO組和Normal組（P<0.05）。見表1、圖1、圖2。

3 討論

研究證實(shí)腦出血大鼠進(jìn)行BMsCs移植，細(xì)胞能存活、遷徙，分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，減少損傷體積，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)[1-2]。百會與大椎均為督脈穴位，督脈與腦密切相關(guān)[7]，電針百會與大椎穴可增加腦的供血，減輕腦的缺血缺氧，減輕腦水腫，減輕膜脂質(zhì)過氧化，進(jìn)而抑制自由基的損傷，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化/抗氧化平衡，減少鈣超載，起到保護(hù)神經(jīng)元的作用[8]。

表1 各組不同時(shí)間血清MBP檢測結(jié)果（±s） U/L

表1 各組不同時(shí)間血清MBP檢測結(jié)果（±s） U/L

★同一時(shí)間點(diǎn)與NS組比較，P<0.05；◆同一時(shí)間點(diǎn)與Ea BMSCs組比較，P<0.05；■同一時(shí)間點(diǎn)與Ea組比較，P<0.05；▼第14天與FO組和Normal組比較，P<0.05

組別 第1天 第3天 第5天 第7天 第14天Ea BMSCs組（n=25） 26.02±2.31 20.17±1.89 21.27±2.83★ 22.15±2.55★ 19.51±2.49★▼Ea組（n=25） 24.35±3.42◆ 18.84±2.17◆ 20.55±1.96★ 23.03±1.83★ 21.41±3.04◆★▼BMSCs組（n=25） 25.32±2.15 21.08±2.64■ 23.32±2.14◆■ 24.56±2.46◆■ 22.34±1.82◆★▼NS 組（n=25） 25.39±2.08 19.78±3.51 24.24±3.07 25.28±3.11 24.33±2.39▼FO組（n=5） - - - - 16.62±1.76 Normal組（n=5） - - - - 15.61±1.94

圖1 各組不同時(shí)間血清MBP檢測結(jié)果分析折線圖

圖2 各組不同時(shí)間血清MBP檢測結(jié)果分析柱形圖

神經(jīng)系統(tǒng)功能主要體現(xiàn)在于信息的轉(zhuǎn)化、傳遞、整合、記憶和運(yùn)用。其中信息有效及時(shí)的傳遞非常重要，而信息的傳遞主要依賴神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)和功能的健全。髓鞘堿性蛋白（MBP）是構(gòu)成神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘的一種堿性蛋白，與髓鞘脂質(zhì)緊密結(jié)合，髓鞘結(jié)構(gòu)與功能的穩(wěn)定，MBP是重要的物質(zhì)基礎(chǔ)，在正常情況下，血清中的MBP含量較低，在有髓纖維發(fā)生脫髓鞘病變時(shí)會明顯上升[9-10]。故MBP含量變化能特異地反映脫髓鞘損害程度，也是神經(jīng)病損的判斷指標(biāo)之一[4，11-12]。腦出血后因?yàn)檎嘉恍?yīng)，可引起髓鞘的崩解，神經(jīng)元的壞死、腦水腫形成等繼發(fā)性損傷，導(dǎo)致細(xì)胞膜破壞，使MBP進(jìn)入血液，其含量升高。研究證實(shí)外傷性腦出血患者，血清MBP含量在早期即顯著升高，與損傷程度和預(yù)后緊密相關(guān)[4，13]，MBP可作為特異的生化指標(biāo)，判斷顱腦損傷程度及預(yù)后。MBP由于降解作用，在傷后24 h應(yīng)下降至正常，艾文兵等[4]研究卻發(fā)現(xiàn)，血清MBP含量常持續(xù)較高水平7～9 d，目前認(rèn)為與顱腦損傷后繼發(fā)性腦損害有關(guān)[4，13]。筆者的研究發(fā)現(xiàn)各治療組在第1天MBP表達(dá)明顯增高，隨后下降，第3天達(dá)波谷后再次上升到第7天達(dá)波峰，隨后下降，但都高于假手術(shù)組和正常組，與艾文兵等[4]研究基本一致。筆者研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，NS組MBP的表達(dá)在第5、7、14天明顯高于其他治療組，Ea BMSCs組MBP表達(dá)比單一電針治療和單一BMSCs移植治療分別在第14天和第5、7、14天有明顯下降。表明電針聯(lián)合BMSCs移植治療更能保護(hù)神經(jīng)纖維減輕脫髓鞘反應(yīng)，減少M(fèi)BP的產(chǎn)生，從而促進(jìn)出血腦性腦損傷的恢復(fù)。

[1] Seyfried D，Ding J，Han Y，et al.Effects of intravenous adminis-tration of human bone marrow stromal cens after intracerebralhemorrhagein rats[J].J Neurosurg，2006，104（2）：313-318.

[2] Seyfried D M，Han Y，Yang D，et al.Mannitol enhances delivery of marrow stromal cellsto the brain after experimental intracerebral hemorrhage[J].Brain Res，2008，1224（1）：12-19.

[3]段希棟，李康增，李守艷.針刺治療腦出血研究纂要[J].實(shí)用中醫(yī)內(nèi)科雜志，2010，24（1）：24-26.

[4]艾文兵，陳玉宏，楊啟建，等.三七總皂普對急性重型顱腦損傷患者血清NSE和MBP含量的影響[J].中國實(shí)用神經(jīng)疾病雜志，2007，10（2）：1-3.

[5]楊朝鮮，周玲，馬芳，等.綠色熒光蛋白標(biāo)記對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長的影響[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2007，11（46）：9234-9237.

[6]林文注，王佩.實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1994：286-290.

[7]莫飛智，賴新生，陳振虎，等.電針與氫化麥角堿對血管性癡呆大鼠腦內(nèi)乙酰膽堿酯酶的作用[J].中國老年醫(yī)學(xué)雜志，2001，21（3）：119-121.

[8]程為平，原田俊英，陳伊，等.針刺“百會”、“大椎”對血管性癡呆大鼠腦內(nèi)NO及NOS的影響[J].中華現(xiàn)代內(nèi)科學(xué)雜志，2007，3（4）：198-200.

[9]曾琳，龍?jiān)谠疲惡銊?，?大鼠坐骨神經(jīng)離斷后髓鞘堿性蛋白的變化研究[J].中國臨床康復(fù)，2002，6（23）：3502-3505.

[10]曾琳，楊恒文，邵陽，等.NGF對坐骨神經(jīng)損傷后腰髓與損傷神經(jīng)MBP含量變化的影響[J].第三軍醫(yī)人學(xué)學(xué)報(bào)，2002，24（3）：326.

[11] Omana-Zapata l，Khabbaz M A，Hunter J C，et al.QX-314 inhabbits ectopic nerve activityassociated with neuropathic pain[J].Brain Res，1997，771（2）：228-231.

[12] Fisher J，Levkovitch V H，Schori H，et al.Vaccination for neuroprotection in themouse optic nerve： implications for optic neuropathies[J].J Neurosci，2001，21（3）：136-139.

[13]范小璇，趙曉平，梁格婷，等.健腦益智膠囊對外傷性腦出血患者血清人髓鞘堿性蛋白含量的影響[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2011，20（4）：400-404.