張光偉+++劉恩岐

[摘要] 動脈粥樣硬化是一種高致殘率和致死率的疾病之一。其分子機制的初步探明已經(jīng)為疾病的預防、診斷和康復檢測提供一些重要的信息，但更深層次的機制未明。該研究概述了近年來蛋白質(zhì)組學技術(shù)的發(fā)展，動物模型中動脈粥樣硬化組織蛋白質(zhì)組學以及人類的動脈粥樣硬化組織蛋白質(zhì)組學的研究進展，并就動脈粥樣硬化組織蛋白組學存在的問題以及發(fā)展方向作了探討。

[關(guān)鍵詞] 動脈粥樣硬化；機制；組織；蛋白質(zhì)組學

[中圖分類號] R543 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2014）06（c）-0195-02

動脈粥樣硬化是血管壁廣泛病變的疾病，從血管壁的輕度增厚、血管管腔的狹窄、冠狀動脈閉塞到最終的心肌梗死。在發(fā)展中以及發(fā)達國家，該疾病是一種其分子機制的初步探明已經(jīng)為臨床的預防、診斷和康復檢測提供一些重要的信息，但更深層次的機制未明。由于蛋白質(zhì)在疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，蛋白質(zhì)組學為進一步的探討疾病機制提供了一種較理想的方法學。當前，動脈粥樣硬化的蛋白質(zhì)學研究主要集中在血清生物學標記的研究，然而組織蛋白質(zhì)組學卻可以深層次研究細胞因子的分泌、動脈壁或細胞。該綜述報道了動脈粥樣硬化的組織蛋白質(zhì)組學最新研究進展。

1 蛋白質(zhì)組學技術(shù)的發(fā)展

目前，蛋白質(zhì)組學的分析技術(shù)已經(jīng)歷了兩代，利用2DE為第一代蛋白分離技術(shù)應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學；在質(zhì)譜中的ESI發(fā)展和最新進展提供了第二代蛋白質(zhì)組學的方法學，該技術(shù)主要以高相液相色譜為基礎(chǔ)，稱為Shotgun蛋白質(zhì)組學或MudPIT。雖然經(jīng)典的蛋白質(zhì)組學方法部分被Shotgun蛋白質(zhì)組學取代，但粥樣斑塊蛋白質(zhì)組學的研究原則上還是主要依靠2DE分析。另外，其他的方法還有LC-MS/MS、抗體或印跡分析以及MS成像，最近組織微陣列（TMAs）是研究血管疾病蛋白表達的強有力的工具。

2 組織蛋白質(zhì)組學在動脈粥樣硬化的研究

2.1 動脈粥樣硬化動物模型的蛋白質(zhì)組學研究

apoE缺陷小鼠是研究動脈粥樣硬化病理學最理想的動物模型。最近有兩項研究以apoE缺陷小鼠為模型，利用2DE分析主動脈的差異表達。第1項研究為不同主動脈損傷（輕度、中度、重度）的小鼠與野生型小鼠比較，分析蛋白差異表達。在銀染膠中鑒定出79個差異表達點，這些是缺陷小鼠動脈粥樣硬化早期出現(xiàn)的免疫活性、氧化應(yīng)激和能量損傷的蛋白質(zhì)。特別是，抗氧化酶蛋白1-Cys只在野生型小鼠主動脈組織中發(fā)現(xiàn)，而氧化形式在apoE缺陷小鼠中高表達。研究還顯示，谷胱甘肽還原酶和蘋果酸酶的增加與粥樣斑塊氧化應(yīng)激和抗氧化反應(yīng)一致。更為有趣的是，在apoE缺陷小鼠粥樣斑塊中出現(xiàn)免疫球蛋白的沉積[1]。第2項研究針對apoE缺陷TLR2部分缺陷或完全敲除的小鼠的主動脈進行經(jīng)典的蛋白質(zhì)組學研究。報道顯示，TLR2+/+小鼠的斑塊內(nèi)單核細胞侵潤、凋亡、脂質(zhì)含量和前炎癥因子增加，平滑肌細胞減少。進一步確認，免疫系統(tǒng)與引起動脈粥樣硬化進展的炎癥反應(yīng)的聯(lián)系，另外還說明了TLR2在此過程中作用。Sypro Ruby膠的差異分析，7種代表氧化應(yīng)激適應(yīng)性反應(yīng)的蛋白（順烏頭酸酶、延胡索酸水合酶、凝溶膠蛋白、血紅蛋白、肌球蛋白輕鏈多肽3、SOD2和Vesl-2）在TLR2+/+小鼠的斑塊高表達[2]。Almofti等利用高膽固醇飲食和維生素D3注射誘導大鼠動脈粥樣硬化模型，研究主動脈差異蛋白表達，通過Colloidal Coomasie 2DE膠和質(zhì)譜分析，鑒定出46個蛋白。18種在疾病組織中過表達，包括一系列氧化過程中的酶如抗氧化酶2、NADH脫氫酶、Fe-S；28種下調(diào)蛋白，包括CaM-kⅢ、轉(zhuǎn)移酶、果糖雙磷酸醛縮酶。任何一個驗證試驗都認為這些蛋白參與動脈粥樣硬化過程[3]。外科學方法誘導的頸動脈狹窄大鼠模型，進行轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學研究，利用2DE和銀染鑒定出16個表達差異點，其中5個為2到3個蛋白的復合體。最終鑒定19種蛋白，其中8種蛋白表達水平與轉(zhuǎn)錄水平一致。這些研究證實，轉(zhuǎn)錄組學可以不必考慮翻譯和翻譯后蛋白水平的調(diào)控[4]。

2.2 人類動脈粥樣硬化標本的研究

目前，人類粥樣斑塊蛋白質(zhì)組學的研究比動物模型更廣泛。不同的蛋白質(zhì)組學技術(shù)相繼被應(yīng)用，從Shotgun蛋白質(zhì)組學或2DE到抗體陣列和質(zhì)譜成像。用于研究的斑塊標本大部分來自頸動脈組織活檢。

3種經(jīng)典的頸動脈組織提取物的蛋白質(zhì)組學從2005相繼報道[5-7]。含血栓的頸動脈斑塊和穩(wěn)定性斑塊比較，進行蛋白質(zhì)組學研究，結(jié)果在含血栓的斑塊中α1-抗胰蛋白酶表達上調(diào)。該結(jié)果最終通過1DE和2DE的免疫印跡驗證。α1-抗胰蛋白酶在炎癥條件下，由肝臟表達，能夠抑制膠原蛋白酶和彈性蛋白酶活性，可能提高斑塊的纖維化[5]。Part等利用2DE對頸動脈動脈粥樣硬化斑塊核心區(qū)和周圍正常區(qū)組織進行蛋白質(zhì)組學研究。21種差異蛋白被鑒定出，其中hsp27被驗證并進行進一步的分析[6]。該蛋白是第一個在頸動脈斑塊分泌研究中發(fā)現(xiàn)的具有潛在的動脈粥樣硬化生物標記物[8]。Part等研究發(fā)現(xiàn)hsp27在斑塊核心區(qū)含量周圍正常區(qū)下降。其他研究結(jié)果與以前的報道相反。免疫印跡顯示，正常組織hsp27表達水平較非動脈粥樣硬化區(qū)，血清hsp27在患者中也增加[6]。通過其他組的后續(xù)研究hsp27水平的下降與高損傷區(qū)的面積和斑塊的不穩(wěn)定性有關(guān)[7，9]。最新的2DE研究包括大量的被分為含穩(wěn)定性和非穩(wěn)定性斑塊頸動脈標本，通過MALDI-TOF質(zhì)譜從膠中鑒別出大量差異點。差異表達分析結(jié)果顯示，在兩組中含有9種差異蛋白，包括上調(diào)蛋白：鐵蛋白輕鏈亞基、纖維蛋白原D、SOD2；下調(diào)蛋白：膜聯(lián)蛋白A1、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶P1-1、HSP20、HSP27、RhoGDI、SOD3。免疫印跡驗證了板塊中含有高水平的纖維蛋白原D，該蛋白的效應(yīng)為增加血管細胞內(nèi)皮通透性、分裂、前炎癥刺激、化學因子的釋放。Sung等建立以主動脈組織活檢為基礎(chǔ)的斑塊2DE。差異分析結(jié)果顯示，39差異點增加，僅有少數(shù)幾個點減少。過表達的蛋白利用MALDI-TOP MS進行鑒定，其中13在動脈粥樣斑塊組中所有膠的1或2中高表達，而其他14個在所有膠中高表達。3個高表達蛋白進行免疫印跡確認，兩個蛋白在所用膠中上調(diào)，包括膜聯(lián)蛋白A5和誘捕受體；1個蛋白僅在1或2塊膠中高表達，該蛋白為14-3-3γ。該研究發(fā)現(xiàn)的下調(diào)蛋白可以作為疾病的生物學標記物如hsp27[10]。endprint

抗體陣列技術(shù)在最近幾年獲得了長足的發(fā)展。該項技術(shù)利用玻片的抗體點樣與蛋白樣本共同孵育，定量比較蛋白質(zhì)表達水平，并進一步發(fā)展為化學發(fā)光技術(shù)。盡管該技術(shù)較簡便，但僅見一例關(guān)于粥樣斑塊提取物的抗體陣列研究。Slevin等用512份抗體設(shè)置陣列探討與穩(wěn)定性斑塊相比較不穩(wěn)定性斑塊蛋白水平的變化。共有21蛋白在穩(wěn)定性斑塊中高表達，3種蛋白水平在穩(wěn)定性斑塊增加。在不穩(wěn)定斑塊中過表達的蛋白有一些為以前研究確認上調(diào)的蛋白如：TNFα、HIFIα、hsp40、CRP2。11種有關(guān)炎癥、血管生成、增殖和凋亡相關(guān)的蛋白通過免疫印跡和免疫組織化學進行確認，TNFα和HIFIα作為內(nèi)參照。免疫印跡不僅對以上兩組進行驗證，另外加非動脈粥樣斑塊的頸動脈組。結(jié)果顯示，與非粥樣斑塊組相比，在斑塊（穩(wěn)定性和非穩(wěn)定性）所有11上調(diào)蛋白進一步確定8種蛋白，包括：TNFα、TRAF4、Gads、GIT1、Caspase-9、c-src、TOPOⅡ-α和JAM-1），免疫組化實驗利用不同的細胞標志物蛋白抗體確定了在組織內(nèi)表達特定蛋白的細胞類型[11]。

Martinet等利用印跡陣列研究頸動脈斑塊和乳房動脈提取物的蛋白差異。他們使用了823份抗體分析信號轉(zhuǎn)導蛋白，發(fā)現(xiàn)15種蛋白表達差異達5倍以上，但免疫印跡只確認7種蛋白，提示該方法易產(chǎn)生假陽性結(jié)果。盡管如此，有意義的蛋白在斑塊中下調(diào)，其中之一與apoE過表達一致。血栓蛋白-2、MnSOD、apo B100、PTP1C在頸動脈中上調(diào)；ALG-2和糖原合成酶-3β下調(diào)。ALG-2的表達通過免疫組化和RT-PCR分析。免疫組化結(jié)果顯示，該蛋白在乳房動脈和粥樣斑塊中低表達，提示通過該技術(shù)不能檢測該蛋白在兩種組織中的變化；RT-PCR也不能檢測到差異，提示蛋白的調(diào)控為轉(zhuǎn)錄后水平[12]。

迄今為止，所有的動脈粥樣硬化蛋白質(zhì)組學研究的標本均為頸動脈或主動脈。雖然冠狀動脈血栓的發(fā)生是心血管死亡率的最大危險因素，但因其取材的困難，還沒廣泛用于蛋白質(zhì)組學的研究。第一個關(guān)于人類冠狀動脈的蛋白質(zhì)組學的報道為簡短報道，研究者利用健康和疾病的冠狀動脈進行2DE，并對膠銀染。結(jié)果顯示，鐵蛋白輕鏈在冠狀動脈中增加。免疫印跡確認了該結(jié)果；RT-PCR顯示，鐵蛋白輕鏈mRNA水平在病變動脈中減少，說明該蛋白為轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控[13]。

最近，Bagnato等利用shotgun蛋白質(zhì)組學研究冠狀動脈斑塊。該方法的對象為水解酶消化的組織，最后用MudPIT方法鑒定蛋白。直接蛋白質(zhì)組學可以有效的應(yīng)用冠狀動脈組織。從石蠟包埋組織可以鑒定225種蛋白，然而，從冰凍組織中卻可以鑒定出558種蛋白。而且他們對冠狀動脈血管壁層進行了激光分離，LC-MS/MS分析分離層，共鑒定出806種蛋白。免疫組化確認了4種在動脈粥樣硬化疾病進展中發(fā)揮作用重要蛋白，這些蛋白在以前未見報道。研究者期望用該方法發(fā)現(xiàn)冠狀動脈提取物中生長因子和細胞因子，但由于濃度太低沒能如愿。因此，他們使用AQUA方法結(jié)合多反應(yīng)監(jiān)控技術(shù)最終檢測出傳統(tǒng)shotgun蛋白質(zhì)組學無法鑒定出的4種蛋白，包括：TGFβ、bFGF、PDGFβ和SDF-1α，其中TGFβ和SDF-1α可以被有效檢測[14]。

3 小結(jié)與展望

伴隨著蛋白質(zhì)組學的快速發(fā)展，研究者們從動物模型和人類所獲的動脈粥樣硬化組織標本中，鑒定出了大量的差異蛋白。這些差異蛋白對探討疾病的機制具有重要作用。但是該研究仍存在一些問題需要解決。首先，嚴重心血管事件（如心肌梗死和腦卒中）的發(fā)生主要由于是動脈粥樣硬化斑塊破裂所形成的血栓導致的。由于斑塊破裂動物模型一直是研究動脈粥樣硬化的瓶頸，因此導致斑塊破裂的原因至今不明。若能夠提高和改進獲取破裂斑塊的人類標本技術(shù)，并結(jié)合蛋白質(zhì)組學技術(shù)，將在對斑塊破裂機制的研究中起重要作用。其次，動脈粥樣硬化是一種涉及多種蛋白、細胞和組織異常的復雜疾病病理過程。盡管人們已經(jīng)利用分離動脈粥樣硬化斑塊組織進行蛋白質(zhì)組學研究，然而這種組織分離技術(shù)還是不夠精細。更精細的組織分離技術(shù)結(jié)合蛋白質(zhì)組學是研究動脈粥樣硬化機制的方向之一。另外，雖然人們已經(jīng)鑒定出動脈粥樣硬化差異蛋白，但是這些差異蛋白在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中是伴隨關(guān)系還是影響著疾病的進程，還需要做更深入的探討。最后，組織中個別蛋白豐度較低和研究方法學通量不大和靈敏度較低等問題也是該領(lǐng)域需要克服的瓶頸。

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（收稿日期：2014-03-29）endprint