王穎立 牛膺筠

近年的研究發(fā)現(xiàn)年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)的病理改變［1］與脈絡(luò)膜和玻璃膜上的基質(zhì)金屬蛋白酶(metrix metalloproteinases，MMPs)和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)水平的改變密切相關(guān)［2］。

眾所周知，視網(wǎng)膜光損傷是研究視網(wǎng)膜變性類疾病(例如AMD)的良好動(dòng)物模型［3］。因此本研究通過建立小鼠光損傷動(dòng)物模型，著重觀察視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細(xì)胞中金屬蛋白酶組織抑制劑-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)及細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶蛋白1(extracellular regulated proteinkinase-1，ERK-1)表達(dá)的變化，同時(shí)應(yīng)用重組人促紅細(xì)胞生成素(recombination human erythropoietin，rhEPO)進(jìn)行小鼠腹腔注射，檢測(cè)其產(chǎn)生的影響，以進(jìn)一步完善我們對(duì)EPO視網(wǎng)膜神經(jīng)保護(hù)作用的認(rèn)識(shí)，從而為AMD的治療尋求新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物與分組 健康成年近交系 BALB/c小鼠52只(104眼)，4周齡，體質(zhì)量18 g左右，購(gòu)自山東醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，雄性，動(dòng)物基因背景為Rpe65 450Leu450，對(duì)光損傷具有高度敏感性。嚴(yán)格遵守SPF級(jí)小鼠喂養(yǎng)條件。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)使用條件符合國(guó)家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。將動(dòng)物隨機(jī)分為單純光照組(24只)、EPO處理組(24只)和正常對(duì)照組(4只)。其中前兩組按光照后處死時(shí)間的不同又分為6 h、12 h、36 h、72 h、96 h和7 d 6個(gè)亞組，每個(gè)亞組各4只8眼。

1.1.2 主要試劑 TIMP-1兔 IgG多抗、ERK-1羊IgG多抗(美國(guó) Santa Cruz公司)，封閉血清、復(fù)合消化液、PV6001免疫組織化學(xué)試劑盒、DAB顯色試劑盒、APES黏片劑(北京中山生物技術(shù)有限公司)，生物素化兔抗山羊抗體(武漢博士德生物技術(shù)有限公司)，3000 U·mL－1rhEPO(沈陽(yáng)三生制藥公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備 將單純光照組和EPO處理組小鼠在12 h明/12 h暗的循環(huán)光照環(huán)境中喂養(yǎng)10 d，暗適應(yīng)10 h。

1.2.2 動(dòng)物模型及給藥 采用自制光照箱建立大鼠光損傷模型(光照箱由中國(guó)海洋大學(xué)光學(xué)研究室研制)，單純光照組小鼠光照前1 h在紅光下用托品酰胺眼液散瞳，共2～3次后，置于6000 Lux光照箱中照射4 h;EPO處理組小鼠光照前2 h腹腔注射rhEPO，劑量為5000 U·kg－1，再散瞳置于同樣條件光照箱中照射4 h。光照過程中，實(shí)驗(yàn)人員戴防護(hù)墨鏡注視小鼠，當(dāng)觀察到小鼠閉瞼時(shí)立刻敲動(dòng)光照箱防止其閉瞼。光照后將小鼠置于暗室中喂養(yǎng)，并分別于光照后6 h、12 h、36 h、72 h、96 h 及7 d 將動(dòng)物處死。

1.2.3 標(biāo)本的取材、固定與切片 將小鼠用頸椎脫臼法處死即刻摘除眼球，脫水、固定。將石蠟包埋好的眼球標(biāo)本，以平行于視神經(jīng)矢狀軸為平面進(jìn)行連續(xù)切片，厚約4 μm。

1.2.4 HE染色 石蠟切片徹底脫蠟、水化，蘇木素染色5 min，氨水返藍(lán)30 s，伊紅染色30 s，脫水、透明，中性樹膠封片［4］;觀察RPE細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.2.5 免疫組織化學(xué)染色 烤片、脫蠟、水化，加體積分?jǐn)?shù)3%H2O21滴，10 min后水洗、擦片;切片加1滴或者50 μL非免疫動(dòng)物血清，放入濕盒10 min;切片加1滴或者50 μL一抗，濕盒內(nèi)4℃冰箱過夜;PBS沖洗，振蕩;切片加1滴或者50 μL PV6001，37℃孵育30 min，PBS沖洗;DAB溶液顯色，自來水終止反應(yīng)，流水沖洗2～3 min;蘇木素復(fù)染15～20 s，自來水沖洗;酒精脫水、透明、中性樹膠封片。

1.3 結(jié)果觀察與數(shù)據(jù)處理 在光學(xué)顯微鏡下，TIMP-1、ERK-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)均為棕黃色，位于RPE細(xì)胞胞漿。陰性細(xì)胞經(jīng)蘇木素復(fù)染后，RPE細(xì)胞呈藍(lán)色或淺藍(lán)色。每只眼球取兩張切片，應(yīng)用Imagepro plus圖像分析系統(tǒng)對(duì)免疫組織化學(xué)切片進(jìn)行圖像分析(每張切片取4個(gè)視野，以視神經(jīng)為基準(zhǔn)分別向兩側(cè)各取2個(gè)視野)，計(jì)算每組8個(gè)眼球的平均OD值，作為陽(yáng)性細(xì)胞的平均OD值，從而對(duì)RPE細(xì)胞中TIMP-1和ERK-1蛋白表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量分析。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果

2.1.1 形態(tài)學(xué)觀察 正常對(duì)照組 BALB/c小鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)層次分明，視桿細(xì)胞內(nèi)、外節(jié)排列整齊規(guī)則，分界清晰;外核層排列緊密，染色均勻，RPE細(xì)胞呈單線狀排列，細(xì)胞形態(tài)規(guī)整(圖1)。

單純光照組光照后6 h，視網(wǎng)膜桿狀細(xì)胞外節(jié)輕微空泡變性，其余各層未見明顯改變;光照后12 h，桿狀細(xì)胞內(nèi)、外節(jié)排列稍紊亂，外核層變薄，RPE細(xì)胞排列疏松;光照后36 h，內(nèi)、外節(jié)排列紊亂，分界不清，外核層明顯變薄，細(xì)胞間隙加大，出現(xiàn)核濃染及一些不規(guī)則細(xì)胞核，RPE細(xì)胞明顯腫脹、邊界不清、形態(tài)不規(guī)則;光照后7 d，內(nèi)、外節(jié)出現(xiàn)大的空泡樣變性，外核層部分消失，僅殘留少量破碎的細(xì)胞核，RPE細(xì)胞出現(xiàn)丟失、雙層現(xiàn)象(圖2)。

EPO處理組，小鼠視網(wǎng)膜組織學(xué)改變較晚發(fā)生且不明顯，光照后6 h和12 h，未見明顯改變;光照后36 h，內(nèi)、外節(jié)出現(xiàn)輕度空泡樣變，RPE細(xì)胞出現(xiàn)輕度腫脹;光照后7 d，內(nèi)、外節(jié)排列稍紊亂，外核層細(xì)胞間間隙加大，未見明顯RPE細(xì)胞丟失、雙層現(xiàn)象。

2.1.2 RPE細(xì)胞密度變化 正常對(duì)照組RPE細(xì)胞密度為(1.61±0.22)mm－2;隨光照后時(shí)間延長(zhǎng)，單純光照組RPE細(xì)胞密度逐漸減少(表1)，光照后7 d RPE細(xì)胞密度與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。光照后相同時(shí)間點(diǎn)，EPO處理組的RPE細(xì)胞密度較單純光照組稍有增加，光照后7 d二者差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

Figure 1 Normal mouse retinal tissue and RPE(arrow，HE，×400).Figure 2 RPE cell disappeared and RPE layer doubledecked at 7 days after irradiation in simple irradiation group(HE，×400) 圖1 正常對(duì)照組小鼠視網(wǎng)膜組織以及RPE形態(tài)(箭頭，HE，×400)。圖2 單純光照組光照后7 d RPE細(xì)胞出現(xiàn)丟失、雙層現(xiàn)象(HE，×400)

表1 光照后不同時(shí)間點(diǎn)單純光照組和EPO處理組RPE細(xì)胞密度變化Table 1 Changes of RPE cell density at different time after irradiation in two groups(cell density/cell·mm －2)

2.2 免疫組織化學(xué)染色

2.2.1 ERK-1免疫組織化學(xué)染色 ERK-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)為棕黃色，位于RPE細(xì)胞的胞漿。正常對(duì)照組視網(wǎng)膜組織無ERK-1陽(yáng)性表達(dá)(圖3)。單純光照組:不同光照時(shí)間點(diǎn)，與正常對(duì)照組中RPE的ERK-1表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＞0.05)。EPO處理組:從光照后6 h起，各亞組均可見到陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞，且隨光照后時(shí)間的推移，陽(yáng)性表達(dá)呈現(xiàn)逐漸遞增的趨勢(shì)，光照后72 h表達(dá)強(qiáng)度達(dá)到高峰(圖4)，光照后7 d ERK-1陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度較前降低(表2);EPO處理組與正常對(duì)照組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.05)。光照后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，EPO處理組均較單純光照組中ERK-1的表達(dá)明顯增強(qiáng)(均為P＜0.05，見表2)。

2.2.2 TIMP-1免疫組織化學(xué)染色 TIMP-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)為棕黃色，主要表達(dá)于RPE細(xì)胞的胞漿。正常對(duì)照組RPE細(xì)胞中可以檢測(cè)到少量棕黃色染色，即TIMP-1弱陽(yáng)性表達(dá)，OD值為23.75±5.75。單純光照組:光照后各時(shí)間點(diǎn)RPE層TIMP-1陽(yáng)性表達(dá)與正常對(duì)照組相比無明顯變化(均為P＞0.05)。EPO處理組:光照后6 h，RPE層開始出現(xiàn)明顯TIMP-1陽(yáng)性表達(dá)，隨著光照后時(shí)間的推移，陽(yáng)性RPE細(xì)胞棕黃色染色強(qiáng)度遞增，光照后96 h TIMP-1表達(dá)強(qiáng)度達(dá)到高峰，而后TIMP-1在RPE層表達(dá)降低(表3)。

光照后6 h、7 d，單純光照組和 EPO處理組中TIMP-1的表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為 P＞0.05)，自光照后12 h起至光照后96 h，各時(shí)間點(diǎn)EPO處理組較單純光照組中TIMP-1的表達(dá)增強(qiáng)(均為P ＜0.05，見表3)。

Figure 3 No ERK-1 expression in normal rat retinal tissue(×400).Figure 4 ERK-1 expression in RPE cell was increased at 72 hours after irradiation in EPO treated group(×400) 圖3 正常對(duì)照組小鼠視網(wǎng)膜組織無ERK-1表達(dá)(×400)。圖4 EPO處理組光照后72 h視網(wǎng)膜RPE細(xì)胞ERK-1表達(dá)明顯增強(qiáng)(×400)

表2 光照后不同時(shí)間點(diǎn)RPE細(xì)胞ERK-1表達(dá)變化的情況Table 2 Expression of ERK-1 in RPE cell at different time after irradiation (IOD，)

表2 光照后不同時(shí)間點(diǎn)RPE細(xì)胞ERK-1表達(dá)變化的情況Table 2 Expression of ERK-1 in RPE cell at different time after irradiation (IOD，)

Note:SL:Simple light-induced group;ET:EPO treated group;Compared with control group，bP ＜0.05，cP ＜0.01

t P 6 hours 8 3.91±1.02 10.09±5.76b Time Case SL ET－2.988 2 ＜0.05 12 hours 8 4.25±1.11 33.15±3.32b－23.350 4 ＜0.05 36 hours 8 5.02±0.57 39.16±4.04c－23.667 2 ＜0.05 72 hours 8 3.76±2.90 49.22±3.93c－26.326 0 ＜0.05 96 hours 8 4.83±1.08 42.83±4.83c－21.716 4 ＜0.05 7 days 8 3.86±0.81 28.75±2.38c－28.002 3 ＜0.05

表3 光照后不同時(shí)間點(diǎn)RPE細(xì)胞TIMP-1的表達(dá)變化Table 3 Expression of TIMP-1 in RPE cell at different time after irradiation (IOD，)

表3 光照后不同時(shí)間點(diǎn)RPE細(xì)胞TIMP-1的表達(dá)變化Table 3 Expression of TIMP-1 in RPE cell at different time after irradiation (IOD，)

Note:Compared with control group，bP ＜0.05，cP ＜0.01(one-way ANOVA，Dunnett t test)

Time Case SL ET t P 6 hours 8 20.50±3.79 22.93±3.80 1.280 6 0.221 1 12 hours 8 26.25±5.36 31.05±3.22b 2.171 2 0.047 6 36 hours 8 25.62±7.57 38.16±4.04c 4.133 3 0.000 5 72 hours 8 26.59±8.45 42.62±4.93c 4.634 5 0.000 2 96 hours 8 24.83±5.08 48.83±7.83c 7.272 9 0.000 0 7 days 8 18.86±3.81 18.75±7.38c 0.037 5 0.970 6

2.2.3 TIMP-1與 ERK-1相關(guān)性 EPO處理組中TIMP-1的表達(dá)與 ERK-1的水平直線相關(guān)(圖5)。EPO處理組RPE中TIMP-1的表達(dá)與ERK-1的表達(dá)正相關(guān)(r=0.79，P=0.03)。

Figure 5 Relationship scatterplot between TIMP-1 and ERK-1 expressions in RPE cell in EPO treated group EPO處理組RPE細(xì)胞中TIMP-1與ERK-1表達(dá)相關(guān)性分析散點(diǎn)圖

3 討論

EPO是一種主要影響紅細(xì)胞生成的細(xì)胞因子，在臨床試驗(yàn)中應(yīng)用rhEPO可以模擬內(nèi)源性EPO在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮多種作用。在視網(wǎng)膜缺血、缺氧損傷中，rhEPO也表現(xiàn)出相應(yīng)的神經(jīng)保護(hù)和促神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用［5］。以往的研究中［6］，發(fā)現(xiàn) rhEPO 腹腔注射后可通過小鼠血-視網(wǎng)膜屏障進(jìn)入視網(wǎng)膜組織，并且可以有效抑制視網(wǎng)膜感光細(xì)胞凋亡，證明外源性EPO具有抑制光損傷造成的視網(wǎng)膜感光細(xì)胞凋亡的作用。本實(shí)驗(yàn)中EPO處理組小鼠RPE細(xì)胞組織學(xué)光損傷改變較晚發(fā)生且不明顯，也進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)論。但是EPO到底是通過什么樣的機(jī)制抑制了視網(wǎng)膜細(xì)胞的凋亡尚不清楚。

MMPs是參與細(xì)胞外基質(zhì)降解的內(nèi)源性蛋白水解酶。TIMPs是MMPs的內(nèi)源性抑制劑，共有4種，其中TIMP-1廣泛分布于組織和體液中［7］。在正常生理狀態(tài)下，TIMPs與MMPs協(xié)同產(chǎn)生，維持動(dòng)態(tài)平衡，在組織重建、腫瘤細(xì)胞遷移、血管生成、傷口愈合等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。但是當(dāng)這種平衡被打破時(shí)，可導(dǎo)致各種疾病和促進(jìn)疾病的惡化。

RPE是血-視網(wǎng)膜屏障的重要組成部分，體外培養(yǎng)的RPE細(xì)胞能分泌 MMPs和 TIMPs［8］。AMD病變過程中MMPs/TIMPs平衡的改變可能與RPE分泌作用的變化密切相關(guān)。因此本研究中，我們將RPE細(xì)胞隨著光損傷后時(shí)間的延長(zhǎng)TIMP-1表達(dá)的變化作為觀察的重點(diǎn)。在研究中發(fā)現(xiàn)，光照后隨時(shí)間延長(zhǎng)，EPO處理組中TIMP-1較單純光照組表達(dá)明顯增強(qiáng)。這證明外源性的EPO可以增加RPE細(xì)胞TIMP-1的表達(dá)。

TIMP-1的主要功能是對(duì) MMP-2、MMP-9的抑制作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的代謝;同時(shí)還在細(xì)胞生長(zhǎng)、繁殖、凋亡及刺激血管生成等生理和病理學(xué)方面發(fā)揮一定的作用［9］。因此我們考慮，小鼠視網(wǎng)膜光損傷后，給予外源性的EPO，RPE細(xì)胞TIMP-1的表達(dá)增加可能發(fā)揮以下幾方面作用:(1)可以與增多的MMP-2、MMP-9相拮抗，抑制其過強(qiáng)的細(xì)胞外基質(zhì)降解作用，促進(jìn)瘢痕的生成，重建MMPs/TIMPs二者的平衡狀態(tài)，維持玻璃膜正常的結(jié)構(gòu)、功能和視網(wǎng)膜光感受器正常的生理功能。(2)TIMP-1可以活化c-Src、PI3-K、Akt等抗凋亡因子，發(fā)揮其抗細(xì)胞凋亡的作用［10］，抑制光損傷造成的感光細(xì)胞、RPE等的凋亡。(3)通過影響內(nèi)皮細(xì)胞的趨化性，抑制新生血管生成過程中的內(nèi)皮細(xì)胞遷移［11］，從而抑制視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜新生血管的生成。以上這些作用還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)?？傊?，我們可以認(rèn)為外源性EPO發(fā)揮對(duì)視網(wǎng)膜光損傷的保護(hù)作用可能與增加RPE細(xì)胞TIMP-1的表達(dá)有關(guān)。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，EPO處理組從光照后6 h起，各亞組均可見到ERK-1陽(yáng)性表達(dá)的RPE細(xì)胞，且隨光照后時(shí)間的推移陽(yáng)性表達(dá)呈現(xiàn)逐漸遞增的趨勢(shì)，光照后72 h表達(dá)強(qiáng)度達(dá)到高峰，并且 ERK-1表達(dá)增高的趨勢(shì)與TIMP-1直線相關(guān)。因此推測(cè)，EPO引起的TIMP-1的分泌和表達(dá)可能經(jīng)由MAPK途徑。

總之，視網(wǎng)膜光損傷過程中MMPs/TIMPs平衡破壞的發(fā)現(xiàn)，為AMD等與光照損傷有關(guān)的疾病的研究打開了一個(gè)新的視窗。EPO對(duì)RPE細(xì)胞TIMP-1分泌調(diào)節(jié)作用的證實(shí)，也為我們進(jìn)一步分析EPO發(fā)揮視網(wǎng)膜光損傷保護(hù)作用的機(jī)制提供了依據(jù)。

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