赫雪飛 劉高勤 陳志剛 陸培榮

翼狀胬肉是眼科常見病、多發(fā)病，其確切發(fā)病機(jī)制尚不明了。病理上翼狀胬肉可見較多的新生血管及纖維增生性改變，其特征是細(xì)胞增殖、組織重組及血管新生［1］。CC-類趨化因子是一類具有結(jié)構(gòu)相似性、相對(duì)分子質(zhì)量為8000～11 000的細(xì)胞因子樣分泌蛋白，與其相應(yīng)受體結(jié)合后參與細(xì)胞增殖、遷移以及血管新生等多種生物學(xué)行為過(guò)程［2-3］。CC-類趨化因子及其受體在調(diào)控血管新生及白細(xì)胞的遷移過(guò)程中起到重要作用［4］，因而CC-類趨化因子及其受體可能在翼狀胬肉的發(fā)病發(fā)展過(guò)程中起重要作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn)CCR3信號(hào)促進(jìn)實(shí)驗(yàn)性角膜新生血管的發(fā)生［5］。因此推測(cè)CCR3信號(hào)可能參與翼狀胬肉的發(fā)生發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR和免疫組織化學(xué)法檢測(cè)CCR3在翼狀胬肉組織中的表達(dá)，并分析局部應(yīng)用地塞米松后CCR3表達(dá)的變化，為明確CCR3信號(hào)在翼狀胬肉發(fā)病中所起的作用奠定基礎(chǔ)，并分析地塞米松在預(yù)防翼狀胬肉術(shù)后復(fù)發(fā)中的可能作用。

1 材料與方法

1.1 試劑 RNeasy Mini Kit及RNALater購(gòu)自Qiagen公司;rTaq酶、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自日本TaKaRa生物技術(shù)公司;引物由南京金斯瑞公司合成;多聚甲醛、TAE、瓊脂糖、DEPC水等購(gòu)自上海生物工程技術(shù)有限公司;兔抗人 CCR3抗體購(gòu)自美國(guó) BD Biosciences公司;免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司;封片劑購(gòu)自美國(guó)Dako公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 樣本來(lái)源及分組 典型的翼狀胬肉組織來(lái)源于在我院行翼狀胬肉切除術(shù)的患者，共30例，男9例，女21例，年齡44～69(56.5±7.1)歲。所有患者均無(wú)其他角結(jié)膜疾病，翼狀胬肉均長(zhǎng)入角膜緣內(nèi)3～4 mm，無(wú)外傷及手術(shù)史。確診后均行翼狀胬肉切除聯(lián)合帶角膜緣上皮的自體結(jié)膜移植術(shù)。事先征得患者同意，隨機(jī)分為用藥組15例，對(duì)照組15例。用藥組術(shù)前2周局部滴用3 g·L－1妥布霉素地塞米松眼液(典必舒)，每日3次，每次1滴;對(duì)照組術(shù)前2周滴用3 g·L－1妥布霉素眼液(托百士)，每日3次，每次1滴。用藥前及術(shù)前監(jiān)測(cè)眼壓無(wú)明顯變化。術(shù)中切除組織后將其分成3份，沿翼狀胬肉長(zhǎng)軸剪切，每份均包含頭部、頸部及體部的上皮組織、纖維血管組織，分別用于RT-PCR、免疫組織化學(xué)和Western blot檢測(cè)。其中用于RT-PCR檢測(cè)的樣本立即置RNA Later保存液中保存于－86℃低溫冰箱，1周內(nèi)提取總RNA。免疫組織化學(xué)檢測(cè)樣本使用40 g·L－1多聚甲醛溶液固定，而Western blot檢測(cè)樣本則置－86℃低溫冰箱冷凍保存。

1.3 RT-PCR檢測(cè)CCR3 mRNA在翼狀胬肉組織中的表達(dá) 取出保存于RNA Later中的翼狀胬肉樣本，應(yīng)用Qiagen公司的mRNA Mini試劑盒抽取角膜組織的總 RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定 A260/280＞1.8。20 μL逆轉(zhuǎn)錄體系中含5 μg總RNA在逆轉(zhuǎn)錄酶催化下42℃逆轉(zhuǎn)錄1 h，合成cDNA。PCR反應(yīng)體系 25 μL，包含0.5 μL cDNA 模板，dNTP 200 μmol·L－1，人趨化因子受體 CCR3 引物(表1)1 mmol·L－1及rTaq DNA聚合酶1 U在PTC-100上擴(kuò)增。起始熱變性94℃ 2 min;接以94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃30 s，35個(gè)循環(huán);最后續(xù)以72℃ 10 min延伸反應(yīng)產(chǎn)物。以GAPDH(25個(gè)循環(huán)反應(yīng)，引物見表1)為內(nèi)對(duì)照。取擴(kuò)增后產(chǎn)物10 μL在15 g·L－1瓊脂糖凝膠中電泳并進(jìn)行溴化乙錠染色，1 kb DNA Ladder作為Marker標(biāo)記DNA分子量，經(jīng)凝膠成像分析系統(tǒng)觀察DNA電泳條帶，獲取數(shù)碼圖像，經(jīng)NIH Image Analysis software分析處理，得出以GAPDH為對(duì)照的相對(duì)值［6］。

表1 RT-PCR引物序列與退火溫度Table 1 Sequences of primers and annealing temperature of RT-PCR

1.4 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)CCR3在翼狀胬肉組織中的表達(dá)及分布 組織經(jīng)40 g·L－1多聚甲醛固定，蔗糖梯度脫水后，OCT包埋冰凍，切片，常規(guī)PBS洗片。體積分?jǐn)?shù)0.3%H2O2孵育30 min，以清除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。PBS洗滌3～5 min。加入正常血清封閉，置于室溫濕盒1 h。吸去封閉液，加以稀釋液配制的抗人CCR3的一抗工作液，4℃過(guò)夜。PBS洗滌3～5 min，3次。加以稀釋液配制的生物素化二抗工作液，室溫1 h。PBS洗滌3～5 min，3次。加以稀釋液配制的親和素-辣根過(guò)氧化物酶復(fù)合物室溫濕盒中孵育1 h。PBS洗滌3～5 min，3次。DAB染色。鏡下控制顯色強(qiáng)度，顯色完成后 PBS洗滌10 min，終止顯色。蘇木素復(fù)染封片［7］。

1.5 Western blot法檢測(cè)翼狀胬肉樣本中 CCR3蛋白的表達(dá) SDS-PAGE結(jié)束后，進(jìn)行免疫印跡。硝酸纖維膜用封閉液封閉，4℃過(guò)夜。第2天加入兔抗人CCR3抗體，室溫孵育1 h，用TBST洗去未結(jié)合的抗體，加入辣根過(guò)氧化物酶羊抗兔IgG多抗，室溫孵育1 h，加入底物ECLA和ECLB混合液顯色。底片曝光后掃描圖片，經(jīng) NIH Image Analysis software分析處理，得出以GAPDH為對(duì)照的相對(duì)表達(dá)值［8］。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。本研究測(cè)量指標(biāo)的數(shù)據(jù)資料用W檢驗(yàn)呈正態(tài)分布，以表示，組間均數(shù)經(jīng) Levene檢驗(yàn)方差齊性。采用完全隨機(jī)分組量水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)照組與用藥組之間各測(cè)量指標(biāo)的差異比較均采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCR3 mRNA在翼狀胬肉組織中的表達(dá)及差異 CCR3 mRNA在所有翼狀胬肉組織中均有不同程度的表達(dá)(圖1A)，但用藥組明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=－5.713，P=0.013;圖1B)，提示翼狀胬肉組織中CCR3表達(dá)水平的改變與藥物作用相關(guān)。

Figure 1 Expression of CCR3 mRNA in pterygium tissue.A:Representative graphs of CCR3 mRNA expression in dexamethasone(dex)group and control(con)group(5 cases in each group);B:CCR3 mRNA relative expression level in dexamethasone group and control group 翼狀胬肉組織中CCR3 mRNA的表達(dá)。A:用藥組和對(duì)照組CCR3 mRNA表達(dá)的代表圖(每組選5例);B:用藥組和對(duì)照組CCR3 mRNA表達(dá)的相對(duì)值

2.2 CCR3在翼狀胬肉組織中的表達(dá)及分布 30例胬肉組織中均有不同程度的CCR3表達(dá)，其表達(dá)主要分布在結(jié)膜上皮細(xì)胞及部分血管內(nèi)皮細(xì)胞上，鏡下見用藥組CCR3的表達(dá)較對(duì)照組表達(dá)低(圖2)。

2.3 CCR3蛋白在翼狀胬肉組織中表達(dá)的差異30例胬肉組織標(biāo)本中均有不同程度的CCR3蛋白的表達(dá)。經(jīng)內(nèi)參GAPDH半定量分析法分析比較發(fā)現(xiàn)，用藥組CCR3的蛋白表達(dá)明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=－3.915，P=0.001;圖 3)。

3 討論

翼狀胬肉是一慢性增生性眼病，臨床表現(xiàn)為新生的組織不斷生長(zhǎng)、增厚，并逐漸侵入角膜，手術(shù)切除后易復(fù)發(fā)，其確切發(fā)病機(jī)制不明。病理學(xué)研究表明，翼狀胬肉組織中伴有大量增生的成纖維細(xì)胞、血管增生和退變，以及球結(jié)膜上皮細(xì)胞的異常增殖［1］。而地塞米松屬于皮質(zhì)類固醇激素，能抑制免疫反應(yīng)，抑制成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，常常應(yīng)用于翼狀胬肉術(shù)后，可抑制增生結(jié)膜向角膜緣生長(zhǎng)，從而防止術(shù)后復(fù)發(fā)。近年研究認(rèn)為翼狀胬肉的發(fā)病與組織中 IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、bFGF 等多種細(xì)胞因子的表達(dá)增高相關(guān)［9］。有研究報(bào)道［10］，術(shù)前應(yīng)用地塞米松可減少術(shù)后復(fù)發(fā)，本研究為了探索趨化因子CCR3在翼狀胬肉術(shù)后復(fù)發(fā)中的作用，采用術(shù)前應(yīng)用3 g·L－1妥布霉素地塞米松眼液局部滴眼，觀察翼狀胬肉組織內(nèi)CCR3表達(dá)的變化。

Figure 2 Immunocytochemical analysis showed CCR3 protein in pterygium tissue in control group and dexamethasone group.A，C:Control group;B，D:Dexamethasone group(A and B:×100;C and D:×400) 免疫組織化學(xué)分析對(duì)照組和用藥組CCR3在翼狀胬肉組織中的分布。A、C:對(duì)照組;B、D 用藥組(A、B:×100;C、D:×400)

Figure 3 Expression of CCR3 in dexamethasone group and control group by Western blot.A:Representative graphs of CCR3 protein expression in dexamethasone group and control group(5 cases in each group);B:CCR3 protein relative expression level in dexamethasone group and control group Western blot檢測(cè)用藥組和對(duì)照組CCR3蛋白表達(dá)。A:用藥組和對(duì)照組CCR3蛋白表達(dá)的代表圖(每組選5例);B:用藥組和對(duì)照組CCR3蛋白表達(dá)的相對(duì)值

CCR3及其配體 Eotaxin是與炎癥、血管發(fā)生等相關(guān)的重要的趨化因子-受體信號(hào)通路。以往報(bào)道認(rèn)為Eotaxin表達(dá)于年齡相關(guān)性黃斑變性患者視網(wǎng)膜色素上皮層［11］。Eotaxin能通過(guò)其受體 CCR3發(fā)揮作用，促進(jìn)年齡相關(guān)性黃斑變性患者脈絡(luò)膜新生血管的形成［12］。但CCR3信號(hào)在翼狀胬肉發(fā)病及發(fā)展過(guò)程中的作用的研究還不多見。我們前期研究發(fā)現(xiàn)CCR3信號(hào)在實(shí)驗(yàn)性角膜新生血管形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。使用CCR3拮抗劑抑制CCR3表達(dá)后，角膜新生血管的發(fā)生明顯降低。提示CCR3信號(hào)是角膜新生血管發(fā)生的促進(jìn)因素。為進(jìn)一步探討CCR3信號(hào)與翼狀胬肉發(fā)病及發(fā)展的相關(guān)性，本研究收集了人的翼狀胬肉標(biāo)本，通過(guò)檢測(cè)CCR3基因和蛋白水平的表達(dá)，了解CCR3在翼狀胬肉組織中的分布情況以及表達(dá)程度，初步分析和判斷出 CCR3信號(hào)與翼狀胬肉的發(fā)病關(guān)系。

本研究中翼狀胬肉標(biāo)本根據(jù)術(shù)前用藥不同分為兩組:用藥組和對(duì)照組。病理性新生血管的發(fā)生是翼狀胬肉發(fā)病的根本因素，而用藥組患者使用的地塞米松具有抑制新生血管發(fā)生發(fā)展的作用，從而具有控制翼狀胬肉生長(zhǎng)的效果。研究檢測(cè)結(jié)果顯示用藥組翼狀胬肉組織內(nèi)CCR3 mRNA和蛋白水平的表達(dá)均較對(duì)照組明顯降低。同時(shí)，CCR3在翼狀胬肉組織上皮和新生血管內(nèi)皮細(xì)胞中有不同程度的表達(dá)。提示CCR3信號(hào)極有可能是翼狀胬肉發(fā)病及發(fā)展過(guò)程中重要的參與因素。

我們課題組前期體外實(shí)驗(yàn)研究了CCR3信號(hào)參與調(diào)節(jié)人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的管腔形成能力，證實(shí)CCR3能促進(jìn)其管腔形成及細(xì)胞增殖以及促進(jìn)NOS表達(dá)［13］。本研究中，用藥組患者局部使用地塞米松后引起CCR3表達(dá)下降，提示CCR3信號(hào)與藥物干預(yù)具有直接相關(guān)性。通過(guò)使用 CCR3拮抗劑、以CCR3信號(hào)作為干預(yù)靶點(diǎn)控制翼狀胬肉及其他新生血管性眼病的發(fā)生發(fā)展是值得進(jìn)一步深入探索的良好路徑。

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