程薪宇，劉玫*，張欣欣，王臣，李濱勝

（1.哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 黑龍江省分子細(xì)胞遺傳與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱150025；2.黑龍江省森林植物園，黑龍江 哈爾濱150040）

毛茛科（Ranunculaceae）為真雙子葉植物基礎(chǔ)類群［1］，約60屬，2500種，世界廣布［2-3］。我國東北地區(qū)分布約20屬，130種［4］。植物通常為草本，含有多種化學(xué)成分，可作藥用，如黃連（Coptis chinensis），升麻（Cimicifuga foetida）和白頭翁（Pulsatilla chinensis）等［5］。長期以來人們依據(jù)胚胎發(fā)育及生殖器官主要特征對毛茛科進(jìn)行分類［6-7］，但結(jié)果一直存在爭議。Takhtajan［2］將毛茛科分為7個(gè)亞科，如唐松草亞科（Thalictroideae）和毛茛亞科（Ranunculoideae），而Cai等［8］將其分為金蓮花亞科（Helleboroideae）等5個(gè)亞科。王文采和李良千［9］根據(jù)花的特征將鐵線蓮屬（Clematis）分為歐洲鐵線蓮亞屬（Subgen.Clematis）等4個(gè)亞屬。趙亮［10］觀察了毛茛族（Trib.Ranunculeae）花的發(fā)生及導(dǎo)管分子的形態(tài)，認(rèn)為水毛茛屬（Batrachium）應(yīng)與堿毛茛屬（Halerpestes）和角果毛茛屬（Ceratocephala）［2］重新并入毛茛屬（Ranunculus）。近年來隨著分子系統(tǒng)學(xué)的發(fā)展，毛茛科的研究有了新的進(jìn)展。Wang和Chen［11］通過對葉綠體rbc L和mat K基因、非編碼trn L-F區(qū)序列，核26S r DNA序列進(jìn)行分析，將唐松草亞科（Thalictroideae）分為3個(gè)類群。Ro等［12］認(rèn)為銀蓮花屬（Anemone）、白頭翁屬（Pulsatilla）、獐耳細(xì)辛草屬（Hepatica）及鐵線蓮屬為單系類群，并認(rèn)為金蓮花屬（Trollius）與側(cè)金盞花屬（Adonis）間存在較近的親緣關(guān)系。然而這些結(jié)果相對缺少形態(tài)學(xué)依據(jù)。研究證明營養(yǎng)器官的一些特征具有重要的分類學(xué)價(jià)值［13-15］。本研究的目的是通過深入研究東北毛茛科植物根、莖和葉的結(jié)構(gòu)，完善東北毛茛科形態(tài)學(xué)，揭示本科植物結(jié)構(gòu)與環(huán)境的關(guān)系，為毛茛科系統(tǒng)學(xué)研究以及植物的利用提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

研究材料于2011－2012年采自黑龍江省，包括我國東北產(chǎn)毛茛科（Ranunculaceae）17屬，27種，4變種成熟植株的根、莖和葉。多數(shù)物種取的是莖生葉，少數(shù)無莖生葉或莖生葉無葉柄的物種取的是基生葉（表1～表3）。

表1 東北毛茛科物種及其憑證標(biāo)本，采集地和采集時(shí)間Table 1 Taxa of Ranunculaceae in northeastern China，together with voucher specimen details and locality

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1.2 方法

GMA（glycol methacrylate，乙二醇甲基丙烯酸酯）切片：活體材料用FAA（formalin－acetic acid－alcohol mixture，福爾馬林－醋酸－酒精混合液）固定，時(shí)間不少于24 h。所研究器官各取3份樣品，經(jīng)50%酒精（每次4～6 h），100%酒精（每次4～6 h），異丙醇（每次6 h）和正丁醇（每次6 h）脫水處理各2次。隨后，進(jìn)入GMA滲透3次，第1和2次各為1 d，第3次不少于5 d，之后將材料及GMA裝入膠囊，置于60℃溫箱24 h進(jìn)行聚合［16］。用Leica Ultralcut R切片，厚度約2.5μm。根據(jù)Feder和O’Brien［16］的方法對材料染色。首先將切片置于DNPH（2，4-Dinitrophenylhydrazine，2，4-二硝基苯肼）冰醋酸混合水溶液30 min，之后流水沖10 min。再將切片置于高碘酸水溶液中10 min，流水沖5 min。之后，將切片置于希弗試劑30 min，流水沖10 min。最后甲苯胺藍(lán)染色2 min，流水沖2～10 min。切片干燥后中性樹膠封片。

撕取葉表皮：撕取葉片背面表皮，50%甘油水溶液封片。觀察表皮細(xì)胞及氣孔形態(tài)、毛狀體類型。隨機(jī)選取30個(gè)氣孔器，利用目鏡測微尺測量并計(jì)算氣孔長寬比及其平均值。所有試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)Olympus BX51顯微鏡觀察，Olympus DP70拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 根的結(jié)構(gòu)

所研究的東北毛茛科植物（表2），除少數(shù)種類（如黃花烏頭和藍(lán)堇草）具發(fā)達(dá)的主根外，多數(shù)具發(fā)達(dá)的須根（如類葉升麻和棉團(tuán)鐵線蓮）。根的橫切面多為圓形或近圓形，僅腺毛箭頭唐松草為方形（圖1-1）。

尖萼耬斗菜和菟葵等植物根表皮細(xì)胞易脫落。其中耬斗菜屬植物根橫切面可見多層木栓細(xì)胞（圖1-2）。其他物種根表皮宿存，這些表皮細(xì)胞通常為薄壁細(xì)胞，如毛茛和貝加爾唐松草。但有些物種的根表皮明顯增厚，如長瓣金蓮花（圖1-3）。腺毛箭頭唐松草表皮下還具一層體積與表皮細(xì)胞相近的細(xì)胞，但細(xì)胞木化（圖1-4）。少數(shù)物種皮層不發(fā)達(dá)（皮層厚度約占根半徑的1／5），細(xì)胞間多無間隙，如黃花烏頭、腺毛箭頭唐松草（圖1-1）。一些物種的皮層較發(fā)達(dá)（皮層厚度約占根半徑的3／5），如黑水銀蓮花（圖1-5）和貝加爾唐松草，細(xì)胞間隙有或無。其余的物種，如長瓣金蓮花、匍枝毛茛（圖1-6）等具極發(fā)達(dá)的皮層（皮層厚度約占根半徑的4／5），有細(xì)胞間隙。一些物種根皮層具發(fā)達(dá)的溶生性通氣組織，如匍枝毛茛（圖1-6）和茴茴蒜。烏頭屬植物，如黃花烏頭靠近根外部的皮層細(xì)胞切向壁伸長，胞壁增厚（圖1-7，見箭頭）。短尾鐵線蓮皮層具纖維，它們與薄壁細(xì)胞相間排列（圖1-8）。

木質(zhì)部導(dǎo)管在絕大多數(shù)物種中呈束狀分布，如腺毛箭頭唐松草（圖1-1）和匍枝毛茛（圖1-6）。但藍(lán)堇草例外，其木質(zhì)部導(dǎo)管呈輻射狀分布（圖1-9）。少數(shù)物種根無次生木質(zhì)部，如菟葵和黑水銀蓮花（圖1-5），其余多數(shù)物種根具次生木質(zhì)部，如興安白頭翁、貝加爾唐松草和藍(lán)堇草（圖1-9）。此外，腺毛箭頭唐松草等少數(shù)物種的木質(zhì)部及韌皮部中有纖維細(xì)胞（圖1-1）。僅少數(shù)物種根的中部具髓，如硬葉水毛茛和黑水銀蓮花（圖1-5）。髓通常為薄壁細(xì)胞，但貝加爾唐松草及腺毛箭頭唐松草根的中部為纖維細(xì)胞（圖1-1）。

2.2 莖的結(jié)構(gòu)

毛茛科植物莖（表2）的表皮細(xì)胞外壁多平滑，僅類葉升麻及唐松草屬表皮細(xì)胞外壁較特殊。前者外壁常具突起（圖1-10）。后者一些物種（如貝加爾唐松草、腺毛箭頭唐松草、唐松草）莖表皮兩細(xì)胞之間的壁微突（圖1-11），此外唐松草屬植物莖的表皮細(xì)胞均具極發(fā)達(dá)的角質(zhì)層（圖1-11）。莖皮層的薄壁組細(xì)胞均具胞間隙，寬葉蔓烏頭、藍(lán)堇草和短尾鐵線蓮（圖1-12）等物種莖皮層還具厚角組織、纖維及木化細(xì)胞。少數(shù)物種的皮層具裂生性通氣組織，如長瓣金蓮花、毛茛及三角葉驢蹄草（圖1-13）。

維管束均屬外韌維管束，且絕大多數(shù)物種莖僅具一圈維管束，如東北扁果草、朝鮮白頭翁和側(cè)金盞花（圖1-14），但黑水銀蓮花具兩圈維管束（圖1-15）。多數(shù)物種韌皮部外圍有纖維細(xì)胞，如棉團(tuán)鐵線蓮（圖1-16），僅毛果銀蓮花和黑水銀蓮花（圖1-15）等少數(shù)植物無纖維。腺毛箭頭唐松草在靠近韌皮部及木質(zhì)部處有纖維（圖1-17），三角葉驢蹄草具維管束鞘纖維（圖1-13）。髓通常為薄壁細(xì)胞，但棉團(tuán)鐵線蓮與貝加爾唐松草髓部細(xì)胞木化。髓腔存在于側(cè)金盞花和三角葉驢蹄草（圖1-13）等多數(shù)物種莖中，少數(shù)物種（如寬葉蔓烏頭和類葉升麻）無髓腔。水葫蘆苗除髓腔外，維管束間還有類似髓腔的腔隙（圖1-18，見箭頭）。側(cè)金盞髓腔周圍具裂生性通氣組織（圖1-14）。

圖1 東北毛茛科植物根，莖及葉柄的橫切面Fig.1 The transverse sections of roots，stems and petioles of Ranunculaceae in northeastern China示表皮、皮層、維管束、纖維、毛狀體、氣孔等結(jié)構(gòu)。1.腺毛箭頭唐松草根；2.耬斗菜根木栓；3.長瓣金蓮花根表皮；4.腺毛箭頭唐松草根表皮；5.黑水銀蓮花根；6.匍枝毛茛根；7.黃花烏頭根皮層；8.短尾鐵線蓮根皮層；9.藍(lán)堇草根木質(zhì)部；10.類葉升麻莖表皮；11.翼果唐松草莖表皮；12.短尾鐵線蓮莖皮層；13.三角葉驢蹄草莖；14.側(cè)金盞花莖；15.黑水銀蓮花莖；16.棉團(tuán)鐵線蓮莖維管束；17.腺毛箭頭唐松草莖維管束；18.水葫蘆苗莖；19.白頭翁葉柄；20.硬葉水毛茛葉柄；21.茴茴蒜葉表皮毛；22.擬扁果草葉表皮毛；23.菟葵葉表皮毛；24.黑水銀蓮花葉氣孔；25.褐毛鐵線蓮葉氣孔；26.朝鮮白頭翁葉氣孔。c.厚角組織；cc.木栓細(xì)胞；co.皮層；cu.角質(zhì)層；e.表皮；f.纖維；lc.木化細(xì)胞；la.溶生性通氣組織；p.髓；pc.髓腔；sa.裂生性通氣組織；vb.維管束；vbs.維管束鞘；v.導(dǎo)管。比例尺：圖1，9，13＝200μm；2～4，10，11，22，23＝25 μm；5，8，17，21，24～26＝50μm；6＝300μm；7，12，15，16，18＝100μm；14＝150μm；19＝500μm；20＝400μm。Showing the structures of epidermis，cortex，vascular bundle，fiber，trichomes，stomata etc.1.Thalictrum simplex var.glandulosum root；2.Root cork of Aquilegia viridiflora；3＆4 Epidermis of roots：3.Trollius macropetalus；4.Thalictrum simplex var.glandulosum；5.Anemone amurensis root；6.Ranunculus repens root；7＆8 Root cortex：7.Aconitum coreanum；8.Clematis brevicaudata；9.Root xylem of Leptopyrum fumarioides；10＆11 Epidermis of stems：10.Actaea asiatica；11.Thalictrum aquilegifolium var.sibiricum；12.Stem cortex of Clematis brevicaudata；13－15 stems：13.Caltha palustris var.sibirica；14.Adonis amurensis；15.Anemone amurensis；16＆17 Vascular bundle of stem：16.Clematis hexapetala；17.Thalictrum simplex var.glandulosum；18.Halerpestes cymbalaria stem；19＆20 Petioles：19.Pulsatilla chinensis；20.Batrachium foeniculaceum；21－23 Showing trichome on leaves：21.Ranunculus chinensis；22.Enemion rad deanum；23.Eranthisstellata；24－26 Stomata of leaves：24.Anemone amurensis；25.Clematisfusca；26.Pulsatilla cernua.c－collenchyma；cc－cork cell；co－cortex；cu－cuticle；e－epidermis；f－fiber；lc－lignified cell；la－lysigenous aerenchyma；p－pith；pc－pith cavity；sa－schizogenous aerenchyma；vb－vascular bundle；vbs－vascular bundle sheath；v－vessel.Scale bar＝200μm in 1，9，13；25μm in 2－4，10，11，22，23；50μm in 5，8，17，21，24－26；300μm in 6；100μm in 7，12，15，16，18；150μm in 14；500μm in 19；400μm in 20.

圖2 東北毛茛科植物葉柄橫切面繪圖Fig.2 The transverse sections of petioles of Ranunculaceae in northeastern China示橫切面形狀、維管束的分布。1.黃花烏頭；2.寬葉蔓烏頭；3.類葉升麻；4.側(cè)金盞花；5.毛果銀蓮花；6.多被銀蓮花；7.黑水銀蓮花；8.尖萼耬斗菜；9.耬斗菜；10.硬葉水毛茛；11.三角葉驢蹄草；12.短尾鐵線蓮；13.褐毛鐵線蓮；14.棉團(tuán)鐵線蓮；15.辣蓼鐵線蓮；16.擬扁果草；17.菟葵；18.水葫蘆苗；19.東北扁果草；20.藍(lán)堇草；21.興安白頭翁；22.朝鮮白頭翁；23.白頭翁；24.茴茴蒜；25.深山毛茛；26.毛茛；27.匍枝毛茛；28.唐松草；29.貝加爾唐松草；30.腺毛箭頭唐松草；31.長瓣金蓮花。x.木質(zhì)部；p.韌皮部。比例尺：圖1～3，5，6，8，12～16，19，21～23，25，28～30＝2 mm；7，9，17＝1.5 mm；10，18，20＝1 mm；4，11，26，31＝3 mm；24，27＝4 mm。Showing the shapes of transverse sections and distribution of vascular bundles.1.Aconitum coreanum；2.A.sczukinii；3.Actaea asiatica；4.A-donis amurensis；5.Anemone baicalensis；6.A.rad deana；7.A.amurensis；8.Aquilegia oxysepala；9.A.viridiflora；10.Batrachiumfoeniculaceum；11.Caltha palustris var.sibirica；12.Clematisbrevicaudata；13.C.fusca；14.C.hexapetala；15.C.terniflora var.mandshurica；16.Enemion raddeanum；17.Eranthis stellata；18.Halerpestes cymbalaria；19.Isopyrum manshuricum；20.Leptopyrum fumarioides；21.Pulsatilla dahurica；22.P.cernua；23.P.chinensis；24.Ranunculus chinensis；25.R.franchetii；26.R.japonicus；27.R.repens；28.Thalictrum aquilegifolium var.sibiricum；29.T.baicalense；30.T.simplex var.glandulosum；31.Trollius macropetalus.x－xylem；p－phloem.Scale bar＝2 mm in 1－3，5，6，8，12－16，19，21－23，25，28－30；1.5 mm in 7，9，17；1 mm in 10，18，20；3 mm in 4，11，26，31；4 mm in 24，27.

2.3 葉的結(jié)構(gòu)

毛茛科植物葉（表3）表皮的附屬物包括單細(xì)胞、多細(xì)胞非腺毛及單細(xì)胞腺毛。單細(xì)胞非腺毛存在于多數(shù)物種，如白頭翁、毛果銀蓮花和茴茴蒜（圖1-21）等。擬扁果草具2～3細(xì)胞組成的單列多細(xì)胞非腺毛（圖1-22）。僅東北扁果草、腺毛箭頭唐松草和菟葵被單細(xì)胞腺毛（圖1-23），其中東北扁果草還被單細(xì)胞非腺毛。極少物種（如貝加爾唐松草和藍(lán)堇草）葉無毛。葉表皮細(xì)胞壁多呈波狀，分為深波（波紋超過細(xì)胞直徑1／3），中波（波紋超占細(xì)胞直徑1／3～1／6）及淺波（波紋小于細(xì)胞直徑1／6）。多數(shù)物種葉片背面表皮細(xì)胞具深波，如寬葉蔓烏頭和黑水銀蓮花（圖1-24），少數(shù)物種具中波，如辣蓼鐵線蓮和褐毛鐵線蓮（圖1-25），朝鮮白頭翁（圖1-26）及棉團(tuán)鐵線蓮等物種葉背表皮細(xì)胞具淺波。除硬葉水毛茛葉背腹面均無氣孔外，多數(shù)物種（如短尾鐵線蓮和毛果銀蓮花）僅葉背面有氣孔。藍(lán)堇草和水葫蘆苗等少數(shù)物種葉腹面也有氣孔。各種氣孔長寬比為1∶1～1∶1.5（如水葫蘆苗和黑水銀蓮花）。

毛茛科植物葉柄橫切面形狀不同，可分為月牙形（如黃花烏頭，圖2-1，2）、倒三角形（如類葉升麻，圖2-3，6，7，17，19，20）、橢圓形（如側(cè)金盞花，圖2-4）、心形（如興安白頭翁，圖2-5，16，21～27，31）、近心形（如耬斗菜，圖2-8，9）、半圓形（硬葉水毛茛，圖2-10）、近月牙形（如三角葉驢蹄草，圖2-11），戟形（如褐毛鐵線蓮，圖2-12～15）、腎形（如水葫蘆苗，圖2-18）及近戟形（如唐松草，圖2-28～30）。葉柄結(jié)構(gòu)多與莖相近，僅個(gè)別物種的葉柄與莖存在區(qū)別，如黑水銀蓮花葉柄僅具一圈維管束。毛茛等大多數(shù)物種葉柄具髓腔，但水葫蘆苗和硬葉水毛茛（圖1-20，見箭頭）僅在維管束間具類似髓腔的腔隙，貝加爾唐松草和類葉升麻等少數(shù)種無髓腔。白頭翁髓部具1～2個(gè)維管束（圖1-19）。

3 討論

角質(zhì)層可減少植物水分蒸發(fā)并可反射紫外線輻射［17-20］，使植物更適于林緣或相對干燥的生境。角質(zhì)層的厚薄受環(huán)境因素的影響［17］，但也受基因的控制［21］。張永紅等［22］觀察了貝加爾唐松草等20種4變種唐松草屬植物葉表皮特征，認(rèn)為蠟質(zhì)層紋飾可作為種間鑒定依據(jù)。本研究的3種唐松草屬植物分別位于唐松草組（Sect.Tripterium）和腺毛唐松草組（Sect.Thalictrum）［23］，它們的莖和葉的表皮均具極為發(fā)達(dá)的角質(zhì)層（其他毛茛科植物沒有發(fā)達(dá)的角質(zhì)層）。

史京華和李良千［24］認(rèn)為在特定類群中，葉表是否雙面具氣孔器對于組及亞組的劃分有一定意義。但本次所選實(shí)驗(yàn)材料，屬內(nèi)氣孔分布方式相同，如白頭翁屬及毛茛屬葉兩面均有氣孔。鐵線蓮屬、銀蓮花屬、烏頭屬、耬斗菜屬及類葉升麻屬等氣孔僅分布于葉背面，且各屬內(nèi)植物間氣孔長寬比也較為接近。因此作者認(rèn)為氣孔的形態(tài)及分布也可以作為屬或亞屬劃分的依據(jù)。

毛茛屬植物、硬葉水毛茛、三角葉驢蹄草、和水葫蘆苗多為水濕生或鹽生植物，它們的根皮層常具溶生性通氣組織［25］，莖及葉柄皮層具裂生性通氣組織［25］。通氣組織可維持組織中適宜的氧水平，有利于氧在根端與苗端間的運(yùn)輸［26］。而通氣組織對于水葫蘆苗等鹽生植物的作用還可緩解根際還原性物質(zhì)對植物的毒害，起到脫毒作用［25］。側(cè)金盞花為早春先葉開花植物，莖髓部的通氣組織可以保證給凍土層中的根提供足夠的氧。

董士香［27］曾認(rèn)為葉組織結(jié)構(gòu)變化是植物進(jìn)化歷程中相對穩(wěn)定的部分。Metcalfe和Chalk［13］認(rèn)為葉柄特征具有較高的系統(tǒng)學(xué)價(jià)值。研究顯示盡管毛茛科不同屬的葉柄切面形態(tài)有差異，但屬內(nèi)不同種較為相似，如白頭翁屬、毛茛屬葉柄切面均為心形，鐵線蓮屬與唐松草屬則為戟形或近戟形?？梢娙~柄切面形態(tài)是分類的重要特征。

Tamura［3］指出毛茛屬［包括水毛茛亞屬（Subgen.Batrachium）］、堿毛茛屬、角果毛茛屬（Ceratocephalus）應(yīng)位于毛茛族中。趙亮［10］綜合了毛茛族花器官發(fā)育和管狀分子及葉表皮特征，認(rèn)為堿毛茛屬、水毛茛屬和角果毛茛屬應(yīng)并入毛茛屬（廣義）。Takhtajan［2］則認(rèn)為毛茛屬、水毛茛屬、堿毛茛屬及角果毛茛屬都應(yīng)分別作為獨(dú)立的屬。我們的研究表明圓葉堿毛茛、硬葉水毛茛與多數(shù)毛茛屬植物營養(yǎng)器官具有相近的結(jié)構(gòu)，如根部表皮為薄壁細(xì)胞，皮層極發(fā)達(dá)，具溶生性通氣組織，導(dǎo)管呈束狀分布，無次生木質(zhì)部，莖皮層具裂生性通氣組織，葉兩面均有氣孔器分布（硬葉水毛茛未見氣孔）及葉表具單細(xì)胞毛。故支持趙亮［10］將堿毛茛屬、水毛茛屬并入毛茛屬的觀點(diǎn)。Tamura［3］曾將驢蹄草屬與金蓮花屬同置于鐵筷子族（Trib.Helleboreae）。Takhtajan［2］則將此二屬分別置于Trollioideae亞科的Caltaeae族和金蓮花族（Trib.Trollieae）。Cai等［8］認(rèn)為將金蓮花屬置于毛茛亞科、驢蹄草屬置于金蓮花亞科中更合適。我們觀察到三角葉驢蹄草與長瓣金蓮花根皮層的結(jié)構(gòu)，莖與葉柄纖維存在的位置及葉表面氣孔的分布等性狀均不同，為Cai等［8］分子系統(tǒng)學(xué)結(jié)果提供了形態(tài)學(xué)依據(jù)。