馬艷艷，李袁飛，成艷芬，朱偉云

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院消化道微生物研究室，江蘇 南京210095）

稻草是我國(guó)反芻動(dòng)物主要粗飼料之一，但由于其粗纖維含量高，適口性差，消化利用率低，造成了資源浪費(fèi)及環(huán)境污染。為了提高稻草的飼用價(jià)值，除了添加礦物質(zhì)和能量飼料外，生產(chǎn)中常對(duì)其進(jìn)行適當(dāng)?shù)募庸ぬ幚?。常?jiàn)的處理方式有物理、化學(xué)和生物處理，其中化學(xué)處理又包括稀酸處理、堿化處理、氨化處理以及氨堿復(fù)合處理。化學(xué)處理能降低稻草粗纖維含量，提高粗蛋白含量。陳廣銀等［1］對(duì)秸稈進(jìn)行堿化處理研究表明，堿化處理不僅能破壞木質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)，也能破壞核酸、氨基酸等含氮物的結(jié)構(gòu)，將其中的氮以NO3--N和NH4＋-N的形式釋放，提高氮的利用率。

反芻動(dòng)物通過(guò)瘤胃微生物發(fā)酵粗纖維獲得能量，但秸稈中的木質(zhì)素與纖維素和半纖維素相互交聯(lián)［2］，導(dǎo)致瘤胃微生物難以降解利用。而化學(xué)處理則可破壞木質(zhì)素與纖維素、半纖維素間的緊密連接，提高微生物對(duì)秸稈的降解率。同時(shí)，氨化處理可形成銨鹽，提高秸稈的總含氮量，使微生物合成微生物蛋白所需的氮營(yíng)養(yǎng)素含量增加，促進(jìn)微生物增長(zhǎng)［3］。王佳堃等［4］利用尿素處理稻草發(fā)現(xiàn)，尿素可以破壞纖維酯鍵，使纖維素暴露，加速纖維素和半纖維素的溶解。Rezaeian等［5］研究也發(fā)現(xiàn)，堿化處理能夠提高木聚糖酶活性，從而提高秸稈降解能力。

目前，對(duì)秸稈化學(xué)處理的研究多側(cè)重于處理前后營(yíng)養(yǎng)成分變化的比較，而對(duì)瘤胃微生物發(fā)酵預(yù)處理秸稈的動(dòng)態(tài)變化研究較少。本研究通過(guò)體外發(fā)酵技術(shù)研究化學(xué)預(yù)處理對(duì)秸稈發(fā)酵動(dòng)態(tài)變化的影響，尋求提高稻草秸稈降解率的最佳處理方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 稻草采集與化學(xué)處理 稻草取自浙江大學(xué)農(nóng)場(chǎng)。選擇清潔、無(wú)污染及無(wú)霉變樣品于65℃烘干，粉碎過(guò)1 mm篩并保存?zhèn)溆谩７謩e添加3.6%NaOH與NH3·H2O、9%NH4HCO3及10%尿素對(duì)稻草進(jìn)行復(fù)合堿化、氨化及尿素化處理。將原料混合均勻并拌濕后裝入密封袋中壓緊，堆放15 d后65℃烘干備用。不同化學(xué)處理稻草的營(yíng)養(yǎng)成分含量見(jiàn)表1。

1.1.2 瘤胃液采集及培養(yǎng)基配制 瘤胃液采自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江浦農(nóng)場(chǎng)3頭裝有永久性瘤胃瘺管的健康成年荷斯坦奶牛。每天7：00和17：00飼喂干物質(zhì)9 kg［青貯玉米秸稈∶苜蓿（Medicago sativa）∶羊草（Leymus chinensis）∶精料＝20∶20∶30∶30；精料主要由玉米（Zea mays）、麩皮、豆粕組成；先粗后精］，自由飲水。早飼前采集瘤胃液并保存于充滿(mǎn)CO2的39℃熱水瓶?jī)?nèi)，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，整個(gè)過(guò)程嚴(yán)格厭氧。參照Theodorou等［6］方法配制培養(yǎng)基，然后與經(jīng)4層紗布過(guò)濾的瘤胃液在厭氧條件下充分混合（體積比為10∶90），厭氧分裝100 m L／瓶（含1 g發(fā)酵底物），39℃靜置培養(yǎng)96 h。

1.2 測(cè)定指標(biāo)與測(cè)定方法

1.2.1 常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分分析 按美國(guó)公職分析化學(xué)師協(xié)會(huì)（Association of Official Analytical Chemists，AOAC）［7］的方法測(cè)定試驗(yàn)樣品中干物質(zhì)（dry matter，DM）、粗蛋白（crude protein，CP）、粗脂肪（ether extract，EE）和粗灰分（ash content，Ash）含量，采用 Van Soest和Robertson［8］的方法測(cè)定中性洗滌纖維（neutral detergent fiber，NDF）及酸性洗滌纖維（acid detergent fiber，ADF）含量。計(jì)算底物干物質(zhì)消失率（disappearance rate of dry matter，DMD）、中性洗滌纖維消失率（disappearance rate of neutral detergent fiber，NDFD）和酸性洗滌纖維消失率（disappearance rate of acid detergent fiber，ADFD）。

表1 不同化學(xué)處理稻草營(yíng)養(yǎng)成分分析Table 1 Chemical composition of experimental roughages %

1.2.2 發(fā)酵指標(biāo)測(cè)定 發(fā)酵過(guò)程中測(cè)定動(dòng)態(tài)產(chǎn)氣量，于24，48，72及96 h時(shí)結(jié)束發(fā)酵并測(cè)定發(fā)酵液p H值、揮發(fā)性脂肪酸（volatile fatty acids，VFA）、氨態(tài)氮（NH3-N）及微生物蛋白（microbial protein，MCP）濃度。參照Theodorou等［6］的方法測(cè)定產(chǎn)氣量；參照秦為琳［9］的方法測(cè)定VFA含量；參照 Weathburn［10］的方法測(cè)定NH3-N濃度；采用考馬斯亮藍(lán)比色法測(cè)定MCP濃度。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2007初步整理后用SPSS 17.0進(jìn)行One-Way ANOVA分析，用Duncan’s法進(jìn)行多重比較。試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SEM）表示，當(dāng)P＜0.05時(shí)認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同化學(xué)處理對(duì)稻草體外發(fā)酵累計(jì)產(chǎn)氣量的影響

圖1 不同化學(xué)處理稻草體外發(fā)酵96 h累計(jì)產(chǎn)氣量Fig.1 Cumulative gas production of rice straw with different chemical treatment in vitroCK：對(duì)照組Control；SH：堿化組Sodium hydroxide；AB：氨化組Ammonium bicarbonate；UR：尿素組Urea；下同The same below.

稻草體外厭氧發(fā)酵累計(jì)產(chǎn)氣量變化見(jiàn)圖1。各處理組體外發(fā)酵產(chǎn)氣量變化趨勢(shì)基本一致，發(fā)酵前36 h累計(jì)產(chǎn)氣量迅速增加，隨后增長(zhǎng)緩慢。發(fā)酵36 h時(shí)，堿化組累計(jì)產(chǎn)氣量最高，其次為尿素組和氨化組，對(duì)照組最低；發(fā)酵結(jié)束時(shí)，各組累計(jì)產(chǎn)氣量差異顯著（P＜0.05），堿化組最高，為（208.27±0.87）m L；其次為尿素組和氨化組，分別為（197.15±0.88）和（196.03±0.60）m L；對(duì)照組最低，為（192.18±0.43）m L；其中氨化組稻草和對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 不同化學(xué)處理稻草體外發(fā)酵DMD、NDFD、ADFD變化

稻草體外發(fā)酵DMD、NDFD和ADFD變化見(jiàn)圖2。各處理組DMD、NDFD和ADFD均隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，其中堿化組稻草顯著高于其他各組（P＜0.05），對(duì)照組最低，尿素組與氨化組間差異不顯著（P＞0.05）。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，堿化組與對(duì)照組相比，DMD由31.58%提高到51.36%，NDFD由63.62%提高到82.26%，ADFD由64.39%提高到71.37%。

圖2 不同化學(xué)處理稻草體外發(fā)酵DMD、NDFD、ADFD變化Fig.2 DMD，NDFD，ADFD of rice straw with different chemical treatment in vitro

2.3 不同化學(xué)處理稻草體外發(fā)酵p H值變化

不同化學(xué)處理稻草體外發(fā)酵p H值變化見(jiàn)圖3。各處理組發(fā)酵液p H值隨發(fā)酵時(shí)間不斷降低且發(fā)酵過(guò)程中尿素組p H值均為最高。發(fā)酵結(jié)束時(shí)尿素組和氨化組的p H顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），堿化組與其他各組差異不顯著（P＞0.05）。

2.4 不同化學(xué)處理稻草體外發(fā)酵VFA變化

稻草體外發(fā)酵過(guò)程中VFA變化情況見(jiàn)表2。隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，各處理組VFA濃度逐漸升高；堿化、氨化和尿素組乙／丙呈先升高后降低的趨勢(shì)，48 h時(shí)達(dá)到最高，而對(duì)照組乙／丙則逐漸降低。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，氨化和尿素組發(fā)酵液中乙／丙顯著低于其他2組（P＜0.05），其中氨化組和尿素組差異不顯著（P＞0.05），堿化組和對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）。發(fā)酵不同時(shí)間點(diǎn)各處理組相比，堿化組乙酸、丙酸、丁酸以及總揮發(fā)酸濃度均顯著高于其他各組（P＜0.05），其次為尿素組和氨化組，對(duì)照組最低。

圖3 不同化學(xué)處理稻草體外發(fā)酵的p H值變化Fig.3 p H value of rice straw with different chemical treatment in vitro

2.5 不同化學(xué)處理稻草體外發(fā)酵NH 3-N和MCP變化

稻草體外發(fā)酵NH3-N及MCP濃度變化見(jiàn)圖4。隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)照組和氨化組NH3-N濃度呈先升高后降低趨勢(shì)，堿化組和尿素組則為升高－降低－升高。發(fā)酵各時(shí)間點(diǎn)不同處理組相比，尿素組NH3-N濃度均顯著高于其他各組（P＜0.05），其次為氨化組和堿化組，對(duì)照組最低，堿化組與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）。不同化學(xué)處理稻草體外發(fā)酵MCP濃度介于13.54～20.64 mg／100 m L之間。隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，各處理組MCP濃度先升高后降低，發(fā)酵48 h時(shí)MCP濃度最高。發(fā)酵24，48及72 h不同處理組相比，尿素組MCP濃度最高，對(duì)照組最低，氨化組和堿化組差異不顯著（P＞0.05），發(fā)酵結(jié)束時(shí)各處理組差異不顯著（P＞0.05）。

表2 不同化學(xué)處理稻草體外發(fā)酵VFA變化Table 2 VFA of rice straw with different chemical treatment in vitro

圖4 不同化學(xué)處理稻草體外發(fā)酵NH3-N和MCP濃度變化Fig.4 Concentrations of NH3-N and MCP of rice straw with different chemical treatment in vitro

3 討論

3.1 化學(xué)處理對(duì)稻草營(yíng)養(yǎng)成分及發(fā)酵特性的影響

本研究中復(fù)合堿化、氨化以及尿素化處理均提高了稻草粗蛋白含量，降低了NDF和ADF含量，這可能是因?yàn)榛瘜W(xué)處理不但增加了秸稈非蛋白氮含量，還破壞了木質(zhì)素與纖維素、半纖維素間的酯鍵，使結(jié)構(gòu)性多糖更易被降解。張浩［11］研究不同處理對(duì)稻草營(yíng)養(yǎng)成分的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)氨化處理后稻草粗蛋白含量提高了4.17%，增加了近1倍。邱向峰等［12］對(duì)飼用稻草預(yù)處理的研究表明，稀堿處理能大量溶出稻草中的半纖維素和木質(zhì)素，從而提高稻草纖維素的糖化率。

本研究中堿化組累計(jì)產(chǎn)氣量和干物質(zhì)消失率最高，其次是尿素組和氨化組。這與已有報(bào)道一致。Liu等［13］研究顯示，堿化稻草體外發(fā)酵產(chǎn)氣量顯著高于氨化稻草。龐云芝等［14］研究也顯示，尿素、氨和NaOH處理均能提高稻草體外發(fā)酵產(chǎn)氣量，但NaOH效果最好。艾麗霞等［15］對(duì)不同纖維底物體外發(fā)酵特性的研究表明，粗纖維含量較低，粗蛋白和無(wú)氮浸出物含量較高的底物體外發(fā)酵產(chǎn)氣量較高。本研究中復(fù)合堿處理提高了稻草可發(fā)酵纖維比例及粗蛋白含量，從而提高了稻草干物質(zhì)消失率和總產(chǎn)氣量。

本研究中復(fù)合堿化處理顯著提高了發(fā)酵液中VFA濃度，氨化處理顯著提高了發(fā)酵液中NH3-N及MCP濃度。陳偉健等［16］在研究氨化處理稻草的體外發(fā)酵特性時(shí)發(fā)現(xiàn)，氨化處理能顯著增加反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)主要纖維降解菌產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌和黃色瘤胃球菌的數(shù)量，從而產(chǎn)生大量纖維素酶和半纖維素酶來(lái)加速底物水解增加還原糖生成量，最終大幅提高VFA產(chǎn)量［17］。氨化通過(guò)破壞木質(zhì)素與多糖間的酯鍵，并與多糖形成銨鹽，成為瘤胃內(nèi)微生物合成菌體蛋白的氮源。同時(shí)，氨化處理通過(guò)添加外源氮的方式提高了稻草的含氮量，導(dǎo)致微生物發(fā)酵產(chǎn)生較高的NH3-N，同時(shí)改善了MCP的合成效率。

3.2 稻草發(fā)酵特性的動(dòng)態(tài)變化

從稻草體外發(fā)酵動(dòng)態(tài)變化看，瘤胃微生物在降解可消化養(yǎng)分的同時(shí)，伴隨著產(chǎn)氣量的增加、底物消失率的上升及VFA濃度的升高。由于發(fā)酵產(chǎn)生的VFA不能被及時(shí)消耗而累積造成p H持續(xù)下降。統(tǒng)計(jì)結(jié)果還顯示，各處理組96 h累計(jì)產(chǎn)氣量與其對(duì)應(yīng)的DMD和VFA濃度呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.911和0.972；與p H呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.856。

瘤胃液中NH3-N和MCP濃度反映出日糧蛋白質(zhì)降解與微生物蛋白合成間的動(dòng)態(tài)平衡。本研究中，各處理組NH3-N變化趨勢(shì)為升高－降低－升高，而MCP則呈先升高后降低的趨勢(shì)，二者同時(shí)在發(fā)酵48 h時(shí)達(dá)到最高。飼料蛋白質(zhì)中的易降解組分在培養(yǎng)初期能夠迅速發(fā)酵，所以在發(fā)酵前48 h NH3-N和MCP濃度均有所升高；隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，由于VFA等產(chǎn)物積累引起p H下降，從而影響微生物生長(zhǎng)和對(duì)底物的降解，因此發(fā)酵后期NH3-N和MCP濃度有所降低。發(fā)酵液中NH3-N濃度在發(fā)酵后期呈先下降后升高的趨勢(shì)，可能是細(xì)菌溶菌、纖毛蟲(chóng)自溶或纖毛蟲(chóng)的吞噬作用釋放出氨所致。

4 結(jié)論

化學(xué)處理提高了稻草體外發(fā)酵累計(jì)產(chǎn)氣量、干物質(zhì)消失率以及揮發(fā)性脂肪酸濃度，其中堿化處理效果最好。