耿美玲 鄭 峰 呂 恒 朱 進(jìn) 胡 丹 郝麗娜 張鳳玉龔秀芳 李丙軍 李先富 潘秀珍 王長(zhǎng)軍** 操 敏**

(1.南京軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所，南京210002；2.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京210046)

恙蟲(chóng)病是由恙蟲(chóng)病東方體Orientiatsutsugamushi引起的蟲(chóng)媒傳染病和自然疫源性疾病，鼠類(lèi)為主要傳染源，通過(guò)恙螨幼蟲(chóng)叮咬傳播。恙蟲(chóng)病東方體的56 kDa蛋白是菌體主要外膜蛋白(Stoveretal.,1990)，因其暴露菌體表面、含量豐富以及最常為宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別等特點(diǎn)，因此作為很好的診斷抗原候選者，在ELISA、免疫層析、PCR、qPCR和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)等診斷方法中得到廣泛應(yīng)用(Kimetal.,2011; Blackselletal.,2012)；56 kDa蛋白作為型特異性蛋白，對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增、結(jié)合限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)分析或測(cè)序能將東方體分成不同的基因型(郭恒彬等，1997)；東方體56 kDa蛋白還被證實(shí)與東方體粘附及侵入宿主細(xì)胞能力密切有關(guān), 在L929細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中加入Boryong 株56 kDa重組抗原免疫的小鼠血清，其吸附和生長(zhǎng)分別降低了96 %和91 %(Leeetal.，2008)。此外，56 kDa蛋白還是制備亞單位疫苗的較為理想的候選分子，研究報(bào)道Boryong 株56 kDa重組抗原可誘導(dǎo)對(duì)同源株的細(xì)胞免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng), 保護(hù)小鼠抵抗同源株的再攻擊(Seongetal., 1997a)。攜帶Karp 株?yáng)|方體56 kDa 抗原基因的DNA疫苗，免疫小鼠獲得部分同源保護(hù)作用(Nietal., 2005)。不同株型東方體56 kDa蛋白存在差異，本研究將含有440個(gè)氨基酸的合肥株56 kDa截短蛋白(Qt56)序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)及抗原性分析，同時(shí)將其基因在原核系統(tǒng)克隆表達(dá)，親和層析法純化目的蛋白，Western-blot及ELISA法鑒定其免疫學(xué)活性，為進(jìn)一步研制廣譜診斷試劑、疫苗以及分析其在東方體致病的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒和菌株

表達(dá)質(zhì)粒pET28a為Novage公司產(chǎn)品。大腸桿菌E.coliBL21為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試劑

PCR擴(kuò)增試劑盒、DNA Marker、質(zhì)粒提取試劑盒、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ T4連接酶均為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品。DNA 割膠回收試劑盒購(gòu)自Promega公司, 蛋白Marker為Fermentas公司產(chǎn)品。HRP標(biāo)記的鼠抗人IgG、鄰苯二胺(DAB)顯色液和TMB顯色液購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 序列分析

在GenBank protein 數(shù)據(jù)庫(kù)中,以O(shè).tsutsugamushi為關(guān)鍵詞檢索目的序列。利用Mega 5.0軟件包中的ClustalW對(duì)3株國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株(Karp、Kato、Gilliam)，5株常見(jiàn)株(Kawassaki、Shimokoshi、Kuroki、Yonchon、Boryong), 及國(guó)內(nèi)常見(jiàn)株(Hefei、Guangzhou、Shandong、Neimeng、Taiwan、Ptan)的蛋白進(jìn)行序列分析。

使用DNAStar軟件中的Protean，使用DNAstar軟件中的protean對(duì)上述中的14條蛋白序列進(jìn)行親水性、溶解性及抗原性分析。

1.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將實(shí)驗(yàn)室前期制備的恙蟲(chóng)病東方體合肥株56 kDa截短蛋白基因的PCR產(chǎn)物用DNA回收試劑盒回收純化后，用EcoRⅠ 和BamHⅠ雙酶切，回收純化后與同樣經(jīng)雙酶切后回收純化的質(zhì)粒PET28a連接，構(gòu)建帶有HisTag的重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliBL21，涂布含卡那霉素(100 mg/mL)LB平板，置37℃過(guò)夜。次日隨機(jī)挑取若干個(gè)菌落，分別提取質(zhì)粒，PCR鑒定，陽(yáng)性者進(jìn)一步同時(shí)用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切，電泳檢測(cè)切出約1 320 bp基因片段的質(zhì)粒判斷為陽(yáng)性重組質(zhì)粒.

1.5 重組蛋白的表達(dá)和純化

重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliBL21，菌液擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600約為0.6時(shí)，100 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)4 h，15%SDS-PAGE 電泳檢測(cè)是否有目的蛋白的表達(dá)。將重組體擴(kuò)大培養(yǎng)并經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)，離心收集菌體, PBS 重懸后冰浴超聲破碎菌體，離心后的上清過(guò)濾，用Ni2+離子親和層析柱純化蛋白，并進(jìn)行蛋白復(fù)性。

1.6 Western blot 鑒定

將含有恙蟲(chóng)病東方體合肥株56 kDa截短蛋白重組質(zhì)粒的重組菌在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)設(shè)空質(zhì)粒菌為對(duì)照。離心收集菌體, 超聲破碎，將全菌裂解物分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳，采用電轉(zhuǎn)印法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h；加人抗恙蟲(chóng)病東方體蛋白的血清(1∶200)，37℃孵育1 h；用HRP 標(biāo)記的鼠抗人IgG (1∶4000)37℃孵育1 h；加DAB顯色液顯色。

1.7 ELISA分析

東方體56 kDa截短蛋白基因工程抗原用包被液分別稀釋為5 μg/mL，每孔包被100 μL于96 孔酶標(biāo)板上，置于4 ℃過(guò)夜包被，PBST 洗3次后，用5 %的脫脂奶粉于37 ℃封閉2 h，病人血清分別以1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600稀釋?zhuān)瑫r(shí)用人的正常血清作對(duì)照，37℃孵育1 h， PBST 洗3次，加入100 μL抗人IgG-HRP(1∶4000)，37 ℃孵育30 min，用PBST洗凈，甩干，滴加TMB 顯色，約10 min 后滴加 2 mol/L H2SO4終止，于酶標(biāo)儀450 nm 檢測(cè)OD 值。以不同濃度(5 000、1 000、500、100、80、60、40 ng/mL)的東方體56 kDa截短蛋白基因工程抗原每孔包被100 μL于包被96 孔酶標(biāo)板，置于4 ℃過(guò)夜包被，PBST洗3次后，用5 %的脫脂奶粉于37 ℃封閉2 h，而病人血清以1∶100、1∶200稀釋?zhuān)瑫r(shí)用人的正常血清作對(duì)照，37℃孵育1 h， PBST 洗3次，加入100 μL抗人IgG-HRP(1∶4000)，37 ℃孵育30 min，用PBST 洗凈，甩干，滴加TMB 顯色，約10 min 后滴加 2 mol/L H2SO4終止，于酶標(biāo)儀450 nm 檢測(cè)OD 值。

2 結(jié)果

2.1 序列對(duì)比結(jié)果

利用Megalign及Vector NTI軟件分析，可看出恙蟲(chóng)病東方體合肥株56 kDa截短蛋白包含有完整蛋白的3個(gè)可變區(qū)，分別為：VDⅠ(64-92)、VDⅡ(137-157)、VDⅢ(342-357)(圖1)。

2.2 序列抗原性與理化特性分析結(jié)果

經(jīng)DNAStar分析，發(fā)現(xiàn)在合肥株?yáng)|方體56 kDa截短蛋白氨基酸序列的4個(gè)保守區(qū)親水性曲線，抗原性曲線均呈現(xiàn)較高值(圖2)。

圖1 14條Ot56氨基酸序列相似性分析Fig. 1 Similarity analysis of 14 Ot56 amino acid sequences

圖2 Ot56 氨基酸理化特性分析曲線Fig. 2 Physical and chemical characteristic of amino acid Ot 56 sequence

2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)PCR擴(kuò)增及BamHⅠ/EcoRⅠ雙酶切鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳顯示PCR產(chǎn)物和酶切片段 約1 320 bp，與目的基因大小相符(圖3)。對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行序列分析，結(jié)果顯示克隆的靶基因與已測(cè)序的該段合肥株?yáng)|方體56 kDa部分基因序列完全一致。

圖3 重組質(zhì)粒PET28a::tHefei雙酶切鑒定Fig. 3 Identification of the recombinant plasmid PET28a::tHefei digested by double restriction enzymesM: 250 bp DNA Marker；1：重組質(zhì)粒經(jīng)PCR擴(kuò)增鑒定；2：重組質(zhì)粒; 3：重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切。M: 250 bp DNA Marker; 1: Identification by PCR; 2: The recombinant plasmid; 3: The plasmid digested by BamHⅠ and EcoRⅠ.

2.4 目的蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)及純化

SDS-PAGE 表明，含重組表達(dá)質(zhì)粒的E.coliBL21 經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)后在55 kDa左右處有一條明顯的蛋白條帶，分子量大小與預(yù)期一致。利用His 親和層析柱對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行初步純化，電泳可見(jiàn)一條特異的蛋白條帶，表明得到了較高純度重組蛋白(圖4)。

圖4 SDS-PAGE 檢測(cè)蛋白表達(dá)和純化Fig. 4 Expression and purification analysis of recombinant protein SDS-PAGEM：Marker;1: pET28a空質(zhì)粒；2：未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒；3：IPTG誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒；4：純化蛋白。M：Protein marker； 1：pET28a/BL21； 2： pET28a::tHefei 56kd /BL21 without IPTG induction； 3：pET28a:: tHefei 56kd/BL21 induced with IPTG；4： Purified recombinant protein.

2.5 Western Blot 分析

Western blot 結(jié)果顯示，重組目的蛋白可以與恙蟲(chóng)病病人血清發(fā)生特異性反應(yīng)，在約55 kDa 處出現(xiàn)明顯的條帶(圖5)，表明重組蛋白具有特異的免疫反應(yīng)活性。

圖5 Western blot 分析Fig. 5 Analysis of western blotA.正常人血清；B.恙蟲(chóng)病人血清。M: Marker；1，2: 純化蛋白。A. Negative serum；B. Patient’s positive serum. M：Marker；1，2: Recombinant protein.

2.6 ELISA分析

以5 μg/mL合肥株?yáng)|方體重組抗原濃度包被，稀釋度為1∶12 800病人血清仍可以檢出陽(yáng)性(圖6)，合肥株?yáng)|方體重組抗原濃度最低為80 ng/mL時(shí)仍可有效區(qū)分陰陽(yáng)性血清(圖7)，表明目的蛋白有較強(qiáng)免疫活性。陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)：P/N值(陽(yáng)性孔OD值/陰性孔OD值)大于或等于2.1為陽(yáng)性。

圖6 不同濃度恙蟲(chóng)病人血清的抗體效價(jià)Fig 6 The titer of different concentrations of patients ‘serum

圖7 不同抗原濃度的抗體效價(jià)Fig.7 The titer of different concentration of antigenHefei A：恙蟲(chóng)病人血清濃度1∶100；Control A：正常人血清濃度1∶100；Hefei B： 恙蟲(chóng)病人血清濃度1∶200；Control B： 正常人血清濃度1∶200。Hefei A：Patients’serum concentration 1∶100；Control A：Negative serum concentration 1∶100；Hefei B：Patients’serum concentration 1∶200； Control B：Negative serum concentration 1∶200.

3 討論

恙蟲(chóng)病東方體56 kDa蛋白在東方體的分型、診斷、疫苗研制及致病分子機(jī)制研究中均有重要作用(左小華等，2010)。根據(jù)針對(duì)56 kDa蛋白的分子生物學(xué)分型方法，在世界范圍內(nèi)至少已報(bào)道有超過(guò)30種抗原型別不同的東方體。本課題組前期已對(duì)合肥株56 kDa蛋白的基因進(jìn)行過(guò)分析(操敏等，2013)，本研究對(duì)該部分56 kDa蛋白經(jīng)DNAStar分析，發(fā)現(xiàn)在VDⅠ(64-92)、VDⅡ(137-157)、VDⅢ(342-357)為變異區(qū)，其余為保守區(qū)，與Ohashi 等(1992)等對(duì)Kato、Kawasiki、Shimokoshi、Gilliam、Karp 和Kuorki 6 條不同血清型的Ot 56 序列分析結(jié)果類(lèi)似，與劉昌政(2008)等分析的氨基酸的5個(gè)高可變區(qū)和6個(gè)高保守區(qū)也相符。早在1997年Seong等(1997b)就發(fā)現(xiàn)Boryong株氨基酸的19～113、142～203、和243～328 等3個(gè)區(qū)域具有強(qiáng)的抗原反應(yīng)性，而接著Choi等(1999)又發(fā)現(xiàn)該序列的393～432區(qū)域也具有抗原反應(yīng)性。本研究發(fā)現(xiàn)56 kDa截短蛋白氨基酸序列的4個(gè)保守區(qū)ADⅠ(1-64)、 ADⅡ(93-136)、ADⅢ(158-341)、ADⅣ(358-440)處親水性線，抗原性曲線均呈現(xiàn)較高值，提示其可作為診斷、疫苗等設(shè)計(jì)的靶點(diǎn)。合肥株截短56 kDa蛋白基因包含3個(gè)可變區(qū)和大部分穩(wěn)定區(qū)長(zhǎng)約1 350 bp基因序列，含與同型和異型抗體反應(yīng)的抗原表位區(qū)域，將其與表達(dá)載體PET28a 6個(gè)組氨酸尾融合表達(dá)，得到了穩(wěn)定表達(dá)。SDS-PAGE電泳證明誘導(dǎo)后的蛋白表達(dá)顯著，產(chǎn)物經(jīng)鎳(Ni2+)柱親和層析純化后復(fù)性得到目的蛋白。免疫印跡和ELISA結(jié)果證實(shí)，純化蛋白能被患者血清所識(shí)別，與健康正常人血清不起作用，表明其能夠有效區(qū)分恙蟲(chóng)病陽(yáng)性和陰性血清，稀釋到 80 ng/mL的合肥重組抗原仍可檢測(cè)陽(yáng)性血清，具有良好的抗原性，可作為重組抗原取代天然抗原作為診斷抗原，達(dá)到經(jīng)濟(jì)、特異和安全的目的。

本課題組近年來(lái)研制了以東方體平潭株和Gilliam株基因工程抗原混合為診斷抗原的恙蟲(chóng)病膠體金快速診斷試劑(Caoetal.，2007)，適用于基層部隊(duì)及疫區(qū)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。但有研究報(bào)道東方體抗原對(duì)同型抗體能起較強(qiáng)反應(yīng)，而對(duì)異型抗體反應(yīng)微弱甚至不起反應(yīng)(Ohashietal.,1988; Choietal.,1999；Kimetal., 2013)。因此，將不同東方體型別抗原混合作為診斷抗原，可能將有利于進(jìn)一步提高該試劑的敏感性，擴(kuò)大其檢測(cè)譜。本研究獲得的重組抗原，有望與其他型別56 kDa蛋白混合作為重組抗原制備廣譜的恙蟲(chóng)病膠體金快速診斷試劑盒，或單獨(dú)作為診斷抗原，制備具有地域特點(diǎn)的診斷試劑。同時(shí)，還可進(jìn)一步用于恙蟲(chóng)病的疫苗制備，分子致病機(jī)制的等研究。