范 瑞 姜志強(qiáng) 李雅娟 高小強(qiáng) 錢(qián) 聰 高 敏

(大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 大連 116023)

近年來(lái), 由于我國(guó)海水魚(yú)類(lèi)資源過(guò)度利用以及環(huán)境污染等問(wèn)題, 加快了海水魚(yú)類(lèi)資源的衰退,再加上近親繁殖嚴(yán)重, 遺傳多樣性降低, 造成了一系列種質(zhì)退化現(xiàn)象, 因此, 魚(yú)類(lèi)種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)及改良尤為重要。太平洋鱈(Gadus macrocephalus)又名大頭鱈, 隸屬鱈形目、鱈科、鱈屬(Gadus), 屬冷水性底層魚(yú)類(lèi), 分布于太平洋北部沿岸海域, 從北太平洋西南部的黃海, 經(jīng)韓國(guó)至白令海峽和阿留申群島一帶沿海, 我國(guó)太平洋鱈主要產(chǎn)于黃海, 最高年產(chǎn)量達(dá)到2.6×107kg, 是我國(guó)北方乃至世界的重要海洋經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)之一。太平洋鱈具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值, 它的蛋白質(zhì)含量高, 脂肪含量低, 其肉質(zhì)白細(xì)鮮嫩, 清口不膩, 世界上不少?lài)?guó)家把鱈魚(yú)作為主要食用魚(yú)類(lèi)[1]。除鮮食外, 還加工成各種水產(chǎn)食品,此外鱈魚(yú)肝大而且含油量高, 含豐富的維生素 A和 D, 是提取魚(yú)肝油的原料。另外, 太平洋鱈生長(zhǎng)溫度低, 耐嚴(yán)寒, 生長(zhǎng)耗能少, 對(duì)于彌補(bǔ)我國(guó)北方冬季深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖種類(lèi)缺乏及室內(nèi)工廠(chǎng)化養(yǎng)殖品種的選擇提供了新的思路, 但是由于近年來(lái)太平洋鱈過(guò)度捕撈、環(huán)境污染嚴(yán)重、產(chǎn)卵地的破壞等使其產(chǎn)量大幅度降低, 嚴(yán)重威脅了其種群資源。因此,積極開(kāi)展太平洋鱈的人工育苗與養(yǎng)殖對(duì)太平洋鱈種質(zhì)資源的恢復(fù)及北方深水網(wǎng)箱的有效利用具有重大意義。目前, 國(guó)外對(duì)同屬大西洋鱈研究的較多,Ghigliotti, et al.[2]研究表明大西洋鱈核型為16m/sm+30st/t, 且通過(guò)熒光免疫雜交技術(shù)對(duì)染色體上18S和5S rDNA進(jìn)行了定位研究, 為大西洋鱈遺傳圖譜的建立奠定了基礎(chǔ)。Ghigliotti, et al.[3]通過(guò)靜水壓方法成功誘導(dǎo)了大西洋鱈雌核發(fā)育二倍體, 并進(jìn)一步完善了大西洋鱈全雌化理論和性別決定機(jī)制。而有關(guān)太平洋鱈的研究主要集中在種群分布[4,5]、繁殖生物學(xué)[6,7]、早期發(fā)育[8]以及遺傳多樣性[9]等方面, 在細(xì)胞遺傳學(xué)特別是染色體核型研究還較少, 而在國(guó)內(nèi)關(guān)于太平洋鱈的研究也只是在繁殖及早期脅迫研究等方面, 如姜志強(qiáng)等[10]對(duì)大連海域太平洋鱈的繁殖力、卵徑分布、性腺指數(shù)和肝指數(shù)進(jìn)行周年調(diào)查, 充分闡述了太平洋鱈不同發(fā)育階段性腺發(fā)育特點(diǎn)和營(yíng)養(yǎng)來(lái)源; 王偉等[11]對(duì)不同溫度脅迫下太平洋鱈仔稚魚(yú)成活率及生理生化進(jìn)行了研究, 結(jié)果表明培育溫度為 8℃時(shí), 仔稚魚(yú)成活率最高, 15℃時(shí)最低, 且體內(nèi)抗氧化還原酶系在溫度脅迫下最先表現(xiàn)出變化, 其他方面幾乎為空白。因此, 在本研究中, 作者對(duì)大連海域的太平洋鱈染色體核型進(jìn)行了比較分析, 以期了解其遺傳背景, 為開(kāi)展太平洋鱈的人工育苗提供細(xì)胞遺傳學(xué)參數(shù), 也為其種群恢復(fù)、種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)、遺傳育種及演化地位提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用魚(yú)采自遼寧省大連市黑石礁海區(qū), 為性腺發(fā)育成熟的野生太平洋鱈, 共5尾(3♂, 2♀), 體質(zhì)量為(520—990) g?；铙w運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室放置于 14℃海水充氣暫養(yǎng)。

1.2 染色體的制備

樣本前處理 參照林義浩[12]PHA直接注射法制備染色體標(biāo)本。實(shí)驗(yàn)前一天注射PHA(6 μg/g魚(yú)體重), 18h后, 第二次注射PHA劑量同上, 5h后活體腹腔注射0.1%秋水仙素(6 μg/g魚(yú)體重)。

腎懸浮液的制備 注射秋水仙素2.5h后實(shí)驗(yàn)魚(yú)斷尾放血15min, 取頭腎置于生理鹽水中多次沖洗, 棄去組織碎塊并剪碎, 用紗布過(guò)濾細(xì)胞懸液至離心管中, 1500 r/min離心5min, 用生理鹽水洗滌細(xì)胞2次, 再用0.075 mol/L 的KCl溶液于低滲處理30min, 最后用新鮮配制的卡諾氏液(甲醇︰冰醋酸=3︰1 v/v)固定3次, 每次15min。

制片 采用冷滴片法制片, 空氣干燥過(guò)夜。完全干燥的染色體玻片用pH為6.8的磷酸緩沖液配置的體積分?jǐn)?shù)為10%的Giemsa染色液染色45min,自然干燥后顯微鏡觀察拍照。

核型分析 選取圖像清晰、染色體分散較好的中期分裂相計(jì)數(shù)以確定染色體數(shù)目, 并選出10個(gè)染色體分散良好、形態(tài)清晰、長(zhǎng)度適中的中期分裂相在油鏡下進(jìn)行顯微照相、放大、測(cè)量、統(tǒng)計(jì), 根據(jù) Levan, et al.[13]的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類(lèi)、配對(duì)和核型分析。染色體相對(duì)長(zhǎng)度計(jì)算公式: 染色體相對(duì)長(zhǎng)度=(實(shí)測(cè)長(zhǎng)度/全部染色體長(zhǎng)度總和)×100。

1.3 Ag-NORs顯帶

參照Howell, et al.[14]的快速銀染法略加修改。將 50% AgNO3溶液與 2% 明膠溶液(內(nèi)含 1%甲酸)以2︰1比例混合后, 立即均勻滴加到染色體標(biāo)本上,加蓋玻片; 70 ℃處理2—5min。當(dāng)整張玻片呈棕黃色時(shí)取出, 用70℃蒸餾水沖去蓋玻片, 干燥后鏡檢。

2 結(jié)果

2.1 太平洋鱈體細(xì)胞染色體數(shù)目

本實(shí)驗(yàn)對(duì)137個(gè)分散良好、染色體形態(tài)清晰的中期分裂相進(jìn)行計(jì)數(shù)。結(jié)果表明, 染色體數(shù)目為 46的分裂相最多, 有94個(gè), 占68.61%(表1), 由此可確定太平洋鱈二倍體染色體眾數(shù)為46, 即2n=46。

表1 太平洋鱈染色體中期分裂相的統(tǒng)計(jì)結(jié)果Tab. 1 Chromosome numbers of Gadus macrocephalus

2.2 染色體核型

選擇分散良好, 形態(tài)清晰, 數(shù)目完整的染色體中期分裂相進(jìn)行顯微拍照, 測(cè)量其染色體臂長(zhǎng), 計(jì)算出染色體相對(duì)長(zhǎng)度, 臂比并統(tǒng)計(jì)染色體類(lèi)型。結(jié)果分析表明, 太平洋鱈染色體核型公式為:2n=8m+6sm+20st+12t, NF=60, 即有 4對(duì)中部著絲點(diǎn)染色體(m)、3對(duì)亞中部著絲點(diǎn)染色體(sm)、10對(duì)亞端部著絲點(diǎn)染色體(st)和 6對(duì)端部著絲點(diǎn)染色體(t), 染色體臂數(shù)(NF)為60 (圖 1、圖2)。在進(jìn)行了顯微拍照的染色體中期分裂相中, 太平洋鱈染色體的大小差異較大, 最大染色體相對(duì)長(zhǎng)度為6.53±0.11, 最小染色體相對(duì)長(zhǎng)度為 2.37±0.03, 在第 12對(duì)染色體中有 l個(gè)亞端部著絲點(diǎn)染色體帶有明顯的次縊痕。雌魚(yú)與雄魚(yú)的染色體核型無(wú)明顯差異, 未發(fā)現(xiàn)與性別相關(guān)的異型染色體。染色體核型分析數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

2.2 Ag-NORs帶型

太平洋鱈銀染位點(diǎn)清晰可見(jiàn), 對(duì)中期分裂相 85個(gè), 間期核 50個(gè)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析, 太平洋鱈Ag-NORs的數(shù)目為1—3, 在不同細(xì)胞中表現(xiàn)出多態(tài)性且各種數(shù)目的 Ag-NORs出現(xiàn)的頻率差異性較大;在間期核中, 具有 2個(gè)銀染位點(diǎn)的比列最高, 占總個(gè)數(shù)的82%, 1個(gè)銀染位點(diǎn)其次, 占總個(gè)數(shù)的12%, 3個(gè)銀染位點(diǎn)的最少為6%。在分裂期, 具有1個(gè)銀染位點(diǎn)的占87.1%, 具有2個(gè)銀染位點(diǎn)的占12.9%。在多數(shù)中期分裂相中, 第12對(duì)同源染色體的一條近著絲粒次縊痕區(qū)具有明顯的銀染位點(diǎn), 并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)Ag-NORs聯(lián)合現(xiàn)象。

表2 太平洋鱈各染色體的相對(duì)長(zhǎng)度和臂比值Tab. 2 The relative length and arm ratio of chromosomes of Gadus macrocephalus

圖1 太平洋鱈染色體中期分裂相(箭頭示次縊痕)Fig. 1 Metaphase chromosomes of Gadus macrocephalus

圖2 太平洋鱈染色體核型分析Fig. 2 Karyotype of Gadus macrocephalus

3 討論

染色體作為遺傳信息的載體, 對(duì)生物的進(jìn)化、變異和生存都至關(guān)重要。在脊椎動(dòng)物中, 開(kāi)展魚(yú)類(lèi)染色體的研究不僅僅對(duì)認(rèn)識(shí)和探索魚(yú)類(lèi)的分類(lèi)系統(tǒng)、進(jìn)化關(guān)系及染色體演化過(guò)程具有重要意義, 還可為魚(yú)類(lèi)遺傳育種提供細(xì)胞遺傳學(xué)依據(jù)[6,16]。到目前為止, 已報(bào)道染色體核型的鱈科魚(yú)類(lèi)8種(包括本研究在內(nèi)), 隸屬于5個(gè)屬。由表3可知, 鱈形目鱈科魚(yú)類(lèi)二倍體染色體數(shù)差異性較大(2n=26-48), 核型組成中中部和亞中部染色體相對(duì)較多, 核型變化呈現(xiàn)多態(tài)性, 且不具與性別相關(guān)的異型染色體。Klinkhardt對(duì)鱈科魚(yú)類(lèi)的研究表明, 鱈科各屬之間核型的高度多變性, 這暗示了染色體臂間倒位和羅伯遜易位可能是該類(lèi)群魚(yú)類(lèi)核型進(jìn)化的主要機(jī)制[17]。Caputo, et al.[18]研究表明形目魚(yú)類(lèi)染色體數(shù)目及臂數(shù)的減少與染色體串聯(lián)融合具有直接關(guān)系。由此可知, 鱈科各屬魚(yú)類(lèi)二倍體染色體數(shù)目差異及核型的多樣性主要是染色體發(fā)生了不同程度的變異所導(dǎo)致的, 即染色體結(jié)構(gòu)在進(jìn)化上發(fā)生了較大變化, 表現(xiàn)出不保守性。

很多研究表明魚(yú)類(lèi)的進(jìn)化程度與染色體有一定的關(guān)系。周暾[19]、小島吉雄[20]等均認(rèn)為在魚(yú)類(lèi)系統(tǒng)進(jìn)化上越是處于上位, 染色體越收斂, 端部著絲點(diǎn)染色體多, 中部和亞中部染色體少或缺。如石斑魚(yú)亞科種類(lèi)染色體大多數(shù)為端位著絲點(diǎn)染色體, 染色體臂數(shù)少, 典型的高位類(lèi)魚(yú)類(lèi)[21]。寬突鱈屬和平頭鱈屬魚(yú)類(lèi)具有較多的中部或亞中部著絲粒染色體,端部著絲粒染色體少, 因此, 在魚(yú)類(lèi)系統(tǒng)演化上應(yīng)屬于低位類(lèi)群, 而其他鱈屬魚(yú)類(lèi)均正好相反, 則屬于中高位類(lèi)群; 也有研究表明[22], 在特定的分類(lèi)類(lèi)群中, 具有較多端部或亞端部著絲粒染色體的種類(lèi)為原始類(lèi)群, 而具有較多中部或亞中部著絲粒染色體的是特化類(lèi)群, 即染色體臂數(shù)多的類(lèi)群比染色體臂數(shù)少的類(lèi)群更為特化。鱈屬中太平洋鱈和大西洋鱈具有相同的染色體數(shù)目, 但太平洋鱈具有相對(duì)較多端部或亞端部著絲粒染色體, 且染色體臂數(shù)相對(duì)少, 屬于鱈屬的原始類(lèi)型, 應(yīng)該是鱈屬魚(yú)類(lèi)演化過(guò)程中較早出現(xiàn)的魚(yú)類(lèi)。 寬突鱈屬的細(xì)身寬突鱈和寬突鱈在核型和染色體數(shù)目相一致, 說(shuō)明了種間進(jìn)化的保守性和分類(lèi)地位的一致性; 青鱈和綠青鱈雖然屬于同一屬, 但染色體數(shù)目、核型及臂數(shù)均不相同,主要是兩個(gè)種群在進(jìn)化過(guò)程中染色體發(fā)生了易位、倒位等重組現(xiàn)象, 表現(xiàn)出了染色體的多態(tài)性。

表3 十種鱈科魚(yú)類(lèi)的染色體特征Tab. 3 Chromosome characteristics of 10 species in genus Gadidae

本實(shí)驗(yàn)中太平洋鱈核型為 2n=46, 8m+6ms+20st+12t, NF=60, Ghigliotti, et al.[2]研究的同屬種大西洋鱈 2n=46, 16m/sm+30st/t, NF=62, 兩者具有相同的染色體數(shù)目, 1對(duì)較大的中部著絲點(diǎn)染色體, 且均未發(fā)現(xiàn)有性別相關(guān)的異染色體, 核型組成上存在一定的差異。毛連菊等[25]研究表明, 魚(yú)類(lèi)染色體臂間倒位可以使端部或亞端部著絲點(diǎn)染色體變?yōu)橹胁炕騺喼胁恐z點(diǎn)染色體, 只改變?nèi)旧w形態(tài)及總臂數(shù), 不改變?nèi)旧w數(shù)目。因此, 太平洋鱈和大西洋鱈核型的差異可能是發(fā)生了染色體臂間倒位。王祖熊等研究表明, 魚(yú)類(lèi)雜交育種中核型越相近, 雜交越能成功[26], 可見(jiàn), 此研究對(duì)太平洋鱈與同屬的大西洋鱈的雜交育種提供了理論依據(jù), 為種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)提供了新的方向。

Ag-NORs的數(shù)目、分布及形態(tài)特征是物種親緣關(guān)系和染色體進(jìn)化的指標(biāo), 且Ag-NORs通常分布在染色體次縊痕和隨體區(qū)域[27,28], 有研究也指出, 核仁組織區(qū)是染色體上與核仁形成有關(guān)的區(qū)域, 位于染色體的次縊痕部位, 次縊痕是染色體上的一個(gè)縊縮的部位, 是核仁組織區(qū)所在的位置, 每種生物的染色體組中一般至少有一條或一對(duì)染色體上有次縊痕, 它可作為鑒定某條染色體的標(biāo)志[29,30]。在本實(shí)驗(yàn)中, 太平洋鱈第12對(duì)同源染色體中有l(wèi)個(gè)亞端部著絲點(diǎn)染色體帶有明顯的次縊痕, 且次縊痕的大小、形態(tài)及位置與Ag-NORs的分析結(jié)果相吻合, 可見(jiàn), 次縊痕所在的位置即為核仁組織區(qū)。有些魚(yú)類(lèi)在中期分裂相中, Ag-NORs僅出現(xiàn)在同源染色體之中的一條上, 稱(chēng)之為NORs的活性異形(NOR activity heteromorphism)[31,32]。在本實(shí)驗(yàn)中, 太平洋鱈大多數(shù)分裂期的同源染色體僅一條短臂末端發(fā)現(xiàn)了銀染位點(diǎn), 與上述結(jié)論相一致, 可見(jiàn)太平洋鱈的同源染色體表現(xiàn)出了 NORs活性異形現(xiàn)象, 這也說(shuō)明了在細(xì)胞有絲分裂過(guò)程中, 太平洋鱈染色體上的rRNA基因轉(zhuǎn)錄活性存在著差異性。

本實(shí)驗(yàn)也經(jīng)過(guò)不斷地摸索最終解決了太平洋鱈染色體制備過(guò)程中劑量和時(shí)間等問(wèn)題, 得出最佳PHA處理劑量為6 μg/g, 作用時(shí)間兩次, 一共 23h,秋水仙素劑量為6 μg/g, 作用時(shí)間為2.5h時(shí)能獲得大量的中期分裂相。

迄今, 對(duì)于鱈形目魚(yú)類(lèi)細(xì)胞遺傳學(xué)研究仍舊相當(dāng)匱乏, 對(duì)鱈魚(yú)資源的開(kāi)發(fā)仍有很大空間, 本文結(jié)果的提出為其他鱈科魚(yú)的核型分析及系統(tǒng)進(jìn)化提供了理論依據(jù), 也為太平洋鱈人工繁育、遺傳育種及種質(zhì)資源的保護(hù)開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。