賈云璐 陳 偉 趙 爽 周起超 宋立榮

(1. 中國科學院水生生物研究所, 淡水生態(tài)與生物技術國家重點實驗室, 武漢430072; 2. 中國科學院大學, 北京 100049)

淡水水體富營養(yǎng)化的加劇導致大量產毒藍藻生長形成水華, 并威脅飲用水安全。水體中存在的藍藻毒素種類很多, 以肝臟毒性著稱的微囊藻毒素(MCs)是最為常見的毒素種類, 因危害性大, 受到的關注也最多[1—5]。

MCs可溶于水[6—8], 其中最主要一種異構體MC-LR[9]在水中的溶解度大于1 g/L。在水中, 藍藻水華釋放出的 MCs主要以溶解態(tài)的形式分布于水柱中, 少量被吸附到底泥或是懸浮物上形成顆粒態(tài)藻毒素[6]。測定水中溶解態(tài)藻毒素, 水樣一般要經過膜過濾去除藻細胞及其他形式 MCs[4,7,10], 但是樣品制備過程尚無標準操作程序可循。為了更準確地測定溶解態(tài)MCs濃度, 評估水中MCs的分布和潛在風險, 本文比較了幾種常見膜過濾樣品制備方法和常規(guī)離心法對溶解態(tài)藻毒素測定結果的影響。本研究將為進一步制定水體溶解態(tài)微囊藻毒素的風險評估標準方法提供一些方法學指導。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑和材料

Millipore超純水儀, 高速低溫離心機(德國eppendorf公司)。HPLC采用島津LC-10A 高效液相色譜系統(tǒng)(日本島津公司), 配備有 UV檢測器和LC-10A數據系統(tǒng)。用于 HPLC分析的 MC-LR,MC-YR和MC-RR標準品購買自WAKO公司(日本),實驗用純毒素純化參考陳偉等建立的方法[11], 并通過國內外三個實驗室比對, 其純度大于 99%, 可以作為標準品使用。實驗中使用濾器和濾膜的規(guī)格和生產廠家等信息如表1所示。

模擬試驗的原水水樣采集于武漢市東湖, 經ELISA方法檢測無藻毒素檢出; 野外水華水樣采集(2011年9月)于安徽省巢湖(Ch-W: N 31°41'47.4", E 117°21'44.8"; Ch-E: N 31°35'32.6", E 117°48'36.9")和江蘇省太湖(Th-W: N 31°26'58.7", E 120°1'43.2";Th-N: N 31°24'39.2", E 120°11'14.3")。

1.2 HPLC (High Performance Liquid Chromatogram)法分析高濃度的微囊藻毒素樣品

分析時所用色譜柱為島津 ODS柱(4.6 mm×150 mm), 檢測波長為238 nm, 流動相為60%甲醇,40%磷酸鹽緩沖液(0.05 mol/L K2HPO4, pH=3), 流速為1.0 mL/min, 進樣量為10 μL。

1.3 IC ELISA(anti-immune complex ELISA)酶聯(lián)免疫法分析低濃度的微囊藻毒素樣品

ELISA試劑盒及測定方法, 參照國標方法GB/T20466-2006。IISMCLR單克隆抗體包被96孔酶標板,4℃過夜, 0.5%明膠封阻, 37℃反應2h, 用PBS-T洗滌3次, 加入毒素標準品和樣品100 mL, 37℃放置1h, 每孔繼續(xù)加入 100 L生物毒化的單克隆抗體,室溫放置 2h, PBS-T洗滌 3次, 以 1︰1000稀釋HRP/Streptavidin (辣根酶標記鏈親和素)加入每孔室溫反應 2h, 加底物 TMBZ顯色, 30min后, 以1 mol/L的H2SO4終止反應, 在450 nm波長測定吸光度A450, 繪制標準曲線, 計算樣品MC的濃度。

表1 過濾膜的基本信息Tab. 1 Basic information of different filter membranes in this study

1.4 純水加標回收實驗

設置微囊藻毒素 MC-LR和 MC-RR濃度不同(0.005、0.025、0.1、0.25、0.5、1.25 μg/mL)處理組,5 mL體系, 經不同濾膜減壓抽濾或濾器處理后, 取樣1 mL置于1.5 mL棕色樣品瓶中, 待檢測。

1.5 原水加標回收實驗

分別取原水水樣(ELISA方法未檢出藻毒素)5 mL, 加入 MC-LR和 MC-RR(濃度分別為 0.25、1.25 μg/mL), 按照1.4中的方法進行處理。

1.6 含高濃度藍藻細胞樣品預處理和測定

采集野外含有藍藻細胞的水樣1 L, 4℃保存待用。分別取100 mL水樣, 采用上述濾膜法去除藻細胞, 濾液混勻后取適量待測。另外, 比較常規(guī)離心法(離心條件為8000、4000 r/min, 5min, 4℃)去除藻細胞效率, 并測定離心后水中MCs含量。以ELISA方法測定各組處理后MCs的含量。

2 結果

2.1 純水內標法

不同濾膜和濾器過濾后回收率如圖 1。在 6個濃度實驗組中, PES針式過濾器前處理后回收率高于其他處理; 玻璃纖維濾膜(GF/C)回收率顯著高于3種孔徑0.45μm微孔濾膜。圖 1中箭頭所指為3種孔徑0.45μm微孔濾膜處理后, 0.1μg/mL的處理組毒素濃度低于HPLC檢出限。0.1μg/mL以下各組采用ELISA進行低濃度藻毒素含量分析。同樣, PES針式小過濾器處理后, MCs的平均回收率在90%以上, GF/C處理后回收率在80%以上。然而其他3種膜處理法的平均回收率相對較低, 在50%左右。表2為不同膜吸附MCs的飽和吸附量, 數據顯示, 每個PES針式過濾器和 GF/C濾膜的飽和吸附量低于1μg, 而其他3種濾膜吸附藻毒素的能力較強, 最高可達每張CA濾膜吸附279.1μg藻毒素。

2.2 原水內標法

圖1 純水加入MCs后不同膜過濾處理的回收率Fig. 1 MCs recovery in Milli-Q water after pretreatments with different membranes

原水中存在大量有機質, 是否會干擾膜過濾法制備樣品測得原水中微囊藻毒素含量？為了回答這一問題, 本研究在不含毒素原水中加入純毒素, 過濾后檢測, 并計算得MCs回收率如圖2。結果與純水加標回收法相近, 即高濃度毒素的各組處理方法回收率高于低濃度, 3種微孔濾膜(0.45 μm)減壓過濾處理后的回收率顯著低于玻璃纖維膜法和針式濾器處理后的各組。

2.3 藍藻水華水樣的預處理和ELISA測定

為了探究采用不同濾膜過濾法對含有野外含高濃度藍藻細胞水樣中溶解態(tài)藻毒素測定的影響, 本研究分別對取自我國太湖和巢湖的樣品進行測定,并系統(tǒng)比較不同處理過程。首先, 采用同樣的過濾膜法前處理水華水樣, 測定各組濾液中MCs濃度見表3?？梢缘贸? GF/C濾膜法和針式濾器處理組獲得的結果較為相近, 而其他 3種膜過濾處理組皆未檢出藻毒素。

此外, 通過藻細胞計數, 評估了不同轉速離心去除水華水樣中藻細胞的效率(表4), 并將離心上層液過濾(GF/C 過濾膜法)后, 測定濾液中 MCs含量(表3)。從表4中可以發(fā)現, 即使在離心轉速為8000 r/min下, 也很難完全去除水華樣品中藻細胞。同時, 表3中離心(過濾)組 MCs濃度皆高于其他組, 且較高的離心轉速處理后測定的溶解態(tài) MCs濃度高于低轉速處理。因此, 即使是低轉速離心處理, 藻細胞也有破裂的風險, 導致藻毒素釋放。

3 討論

膜過濾法在測定水中溶解態(tài)微囊藻毒素中, 不同材質的過濾膜對于微囊藻毒素的親和力和吸附能力不同, 從而, 過濾膜材質選擇至關重要。對于目前使用最為廣泛的是玻璃纖維濾膜, 根據孔徑不同,常見種類有 47 mm A/E 玻璃纖維濾膜(1.0 μm,Gelman Science)[12]、47 mm GF/C 玻璃纖維濾膜(1.2 μm, Whatman)[4,10,13,14]和孔徑為 0.45 μm 的水系濾膜[15]。醋酸纖維濾膜也是一種常見的水系過濾膜, 如液相色譜中常用的 0.22 μm 醋酸纖維濾膜(cellulose-acetate, CA; Axiva, India)[16]。Moran, et al.比較了玻璃纖維濾膜、聚碳酸酯膜和混合纖維素膜在測定葉綠素 a和初級生產力中的性能差異, 指出玻璃纖維濾膜對于DO14C有較強的吸附能力, 使獲得的POC偏高[17]。微囊藻毒素分子雖然是疏水性化合物, 以最常見的 3種結構體為例, 它們的logKow(表征疏水性的參數)分別為 MC-RR(4.4)、MC-LR(4.2)、MC-YR(3.9)。但是分子中含有的羧基和各種氨基酸使其又具有極性化合物的性質。微囊藻毒素可溶于水, 并常以水相存在, 所以MCs不易被水體中顆?；蛩樾嘉絒6—8], 卻可能被親水性強的濾膜, 如各種纖維濾膜吸附。

表2 不同過濾膜的飽和吸附量a(微克/每張濾紙)Tab. 2 The adsorption capacity of different membranes (μg/sheet)

表3 野外水華水樣過濾前后MCs含量變化(微克/升)Tab. 3 Changes in microcystins concentrations in water bloom samples before and after pretreatments with different methods (μg/L)

表4 離心前后藻類細胞密度(×10 cells/L)的變化Tab. 4 Algal cell density(×108 cells/L)before and after centrifugation

微囊藻毒素結構體多達 85種以上[16], Vasconcelos, et al.指出天然水華水體中大部分為 MC-LR(所占比例為45.5%—99.8%)[9], Marina Aboal, et al.也認為MC-LR為主要結構體, 其次為MC-RR[10]。2007年宋立榮等研究指出在中國太湖主要的微囊藻毒素結構體為 MC-RR、MC-LR和 MC-YR。其中MC-RR占 50%以上[1]。所以本研究選取我國自然水體中主要微囊藻毒素異構體MC-RR和 MC-LR作為研究對象。MC-RR分子具有兩個精氨酸, 且分子量較其他結構體大, 導致這兩種毒素異構體在經過同樣的樣品制備步驟后回收率存在一定差異, MC-RR的回收率更低, 例如實驗中經醋酸纖維濾膜過濾處理后, 其平均回收率只有21%。

對于含有大量產毒藻細胞的水樣, 若直接測定溶解態(tài)MCs的含量, 將會引起藻細胞破裂, 胞內藻毒素釋放, 導致測定結果顯著偏高。采用離心法去除藻細胞, 然后測定上清液中藻毒素濃度, 即為原水中溶解態(tài)藻毒素含量, 然而離心法并不能完全去除藻細胞, 反而可能導致產毒藻細胞裂解, 釋放出胞內藻毒素, 導致溶解態(tài)藻毒素濃度上升, 無法正確反映原水中溶解態(tài)MCs含量。

總之, 樣品制備過程對于測定水柱中溶解態(tài)微囊藻毒素非常重要, 不恰當的方法往往會使測得的結果偏低或者偏高, 導致過度低估或者高估溶解態(tài)微囊藻毒素的潛在風險。而采用PES或GF/C材質的濾膜過濾處理水樣較好地去除藻細胞及其他顆粒態(tài)藻毒素, 同時避免在樣品制備過程中藻毒素被濾膜吸附, 可以作為樣品制備方法, 更準確地測定水體中溶解態(tài)藻毒素。