唐 濤，李若萱，李 敏，謝 彤，張美鳳

(1.清華大學(xué)醫(yī)院口腔科，北京 100084;2.安貞醫(yī)院口腔科，北京 100029)

慢性牙周炎的發(fā)生發(fā)展與齦下菌斑中微生物的含量、種類、構(gòu)成都密切相關(guān)［1］。傳統(tǒng)的潔治、齦下刮治等方法雖能清除齦下菌斑，但對(duì)牙周袋內(nèi)的炎癥控制有其局限性，不能終止菌斑內(nèi)致病微生物及其毒性產(chǎn)物的作用。由于全身使用抗生素易出現(xiàn)耐藥和藥物不良反應(yīng)，現(xiàn)代牙周病治療推崇牙周袋局部用藥的給藥方式。羧甲基殼聚糖作為藥物載體注入到牙周袋內(nèi)，藥物從羧甲基殼聚糖載體中完全釋放的時(shí)間應(yīng)接近于羧甲基殼聚糖載體在牙周袋內(nèi)降解的時(shí)間［2］，從而發(fā)揮緩釋作用，具有開(kāi)發(fā)前景。本試驗(yàn)將奧硝唑羧甲基殼聚糖溶膠注入牙周袋后觀察主要牙周臨床指標(biāo)及齦下菌斑微生物學(xué)指標(biāo)的變化，評(píng)價(jià)奧硝唑羧甲基殼聚糖溶膠在牙周炎輔助治療中作用。

1 臨床資料和方法

1.1 奧硝唑羧甲基殼聚糖溶膠的制備

在凈化臺(tái)中稱取羧甲基殼聚糖600 mg經(jīng)Co60消毒后完全溶于30 mL滅菌蒸餾水中，再將奧硝唑450 mg充分溶解處理后，即得含15 g/L奧硝唑與20 g/L羧甲基殼聚糖的奧硝唑羧甲基殼聚糖溶膠。該溶膠呈淡黃透明膠狀，置于棕色容器密閉，4℃保存。

1.2 臨床資料

選擇2011－03—2012－03收治的慢性牙周炎患者65例，納入標(biāo)準(zhǔn):①3個(gè)月內(nèi)未經(jīng)牙周治療且無(wú)應(yīng)用抗生素及避孕藥物史;②無(wú)全身性疾病，婦女無(wú)妊娠;③口腔存留牙＞20個(gè)，且至少有2個(gè)重度牙周袋并獨(dú)立分布于2個(gè)不同的象限作為受檢位點(diǎn)，牙周袋深度(PD)≥4 mm，探診出血(BOP)為陽(yáng)性。最終納入35～55歲慢性牙周炎患者59例，隨機(jī)分為兩組，試驗(yàn)組28例，受檢位點(diǎn)共56個(gè);其中男18人，女10人，采用奧硝唑羧甲基殼聚糖加基礎(chǔ)治療。對(duì)照組31例，受檢位點(diǎn)共62個(gè);其中男19人，女12人，采用牙周基礎(chǔ)治療。

1.3 方法

59例患者治療前用牙周探針采用6點(diǎn)法分別檢查頰或舌側(cè)近中、正中、遠(yuǎn)中6個(gè)位點(diǎn)?；A(chǔ)治療(齦上潔治和齦下刮治根面平整)后，對(duì)照組牙周袋內(nèi)不放藥;試驗(yàn)組牙周袋注入奧硝唑羧甲基殼聚糖溶膠，每次從袋底開(kāi)始注入，以注滿牙周袋為準(zhǔn)(0.1～0.3 mL)，每7 d復(fù)診放藥1次，共4次。分別在治療基線(0 d)后，于7、14、2128 d分別進(jìn)行4次復(fù)診注藥。

1.4 臨床檢查和評(píng)價(jià)

0、7、14、21、28 d 時(shí)進(jìn)行臨床指標(biāo)檢查，采集各受檢位點(diǎn)齦下菌斑，記錄菌斑指數(shù)(PLI)、出血指數(shù)(BI)、探診深度(PD)、附著喪失(AL)。為防止臨床檢查對(duì)標(biāo)本采集的影響，臨床指標(biāo)的檢測(cè)與處理均在齦下菌斑采集后完成。

1.5 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)

1.5.1 齦下菌斑胰蛋白酶樣酶(OD)測(cè)定

齦下菌斑標(biāo)本充分溶于200 μL生理鹽水中，置于震蕩器震蕩30 s備用。為避免菌斑標(biāo)本之間的相互干擾，每個(gè)牙周位點(diǎn)更換一個(gè)無(wú)菌小環(huán)采集標(biāo)本。用苯甲酰精氨酸萘酰胺水解試驗(yàn)(BANA試驗(yàn))檢測(cè)齦下菌斑胰蛋白酶樣酶，BANA工作液的配制∶44 mg BANA(批號(hào):31K1145，Sigma公司)溶于1 mL二甲亞砜中，配置成100 mmol/L貯存液，4℃保存。使用前用pH 8.5，15 mmol/L TBS緩沖液1∶100稀釋成1 mmol/L的BANA工作液。取1 mmol的BANA 100 μL加入酶聯(lián)反應(yīng)板孔內(nèi)，然后加入100 μL待檢菌斑標(biāo)本，37℃孵育過(guò)夜。次日酶聯(lián)反應(yīng)板孔內(nèi)加入0.25%堅(jiān)牢黑K鹽(Fast Black K，批號(hào):61K2512，Sigma公司)50 μL 呈色，37℃，5 min后觀測(cè)結(jié)果。各孔內(nèi)的反應(yīng)結(jié)果經(jīng)ELISA酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定600 nm波長(zhǎng)下的光密度值(OD)。

1.5.2 螺旋體數(shù)目(S%)

臨床所取齦下菌斑立即在滴有2%剛果紅液的干凈載玻片上混合均勻，并涂布成薄層，自然干燥，在盛有濃鹽酸的廣口瓶上熏涂片約1 mm至深藍(lán)色后，在光學(xué)顯微鏡油鏡(×10000)下觀察，隨機(jī)記數(shù)200個(gè)微生物，按形態(tài)記數(shù)螺旋體數(shù)目(S%)。

1.6 臨床療效

①痊愈:癥狀基本消失，檢測(cè)指標(biāo)恢復(fù)正常;②顯效:癥狀基本消失，BI減少＞2級(jí)，PD減少＞1 mm;牙齒松動(dòng)度明顯改善;③有效:BI減少＞l級(jí)，PD減少＞0.5 mm;牙齒松動(dòng)度稍有改善;④無(wú)效:臨床各項(xiàng)指標(biāo)均無(wú)改善，癥狀無(wú)任何緩解。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組實(shí)驗(yàn)前后的臨床指標(biāo)用方差分析。計(jì)量數(shù)據(jù)用()表示，經(jīng)成組資料的t檢驗(yàn);等級(jí)資料(PLI、BI)選用M(QR)方式進(jìn)行描述(M為中位數(shù)，QR表示四分位數(shù)間距)，組間療效比較均應(yīng)用秩和檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果(表1～2)

表1 治療前后各時(shí)間點(diǎn)受檢位點(diǎn)(共118個(gè))臨床指標(biāo)()

表1 治療前后各時(shí)間點(diǎn)受檢位點(diǎn)(共118個(gè))臨床指標(biāo)()

a.與0 d試驗(yàn)組比較P＜0.05;b.與0 d對(duì)照組比較P＜0.05;c.28 d時(shí)與對(duì)照組比較P＜0.05

0 d 試驗(yàn)組 4.48 ±0.360 4.14 ±0.930 5.80 ±0.830 6.23 ±1.490 25.20 ±7.951 0.411 ±0.246對(duì)照組 4.20 ±0.380 4.48 ±0.380 5.74 ±0.930 6.52 ±1.010 23.72 ±8.033 0.465 ±0.4367 d 試驗(yàn)組 1.88 ±0.130a 2.21 ±0.204a 5.81 ±0.503 6.25 ±0.135 10.02 ±8.325a 0.204 ±0.324a對(duì)照組 2.54 ±0.520b 2.54 ±0.371b 5.76 ±0.431 6.54 ±0.108 14.56 ±5.897b 0.295 ±0.265b 14d 試驗(yàn)組 1.24 ±8.650a 1.52 ±0.871a 5.80 ±0.421 6.23 ±0.253 6.82 ±2.467a 0.175 ±0.116a對(duì)照組 1.24 ±9.033b 1.72 ±0.561b 5.74 ±0.123 6.51 ±0.114 12.08 ±3.981b 0.271 ±0.323b 21 d 試驗(yàn)組 0.76 ±9.071a 0.82 ±4.389a 5.83 ±3.162 6.00 ±0.012 4.59 ±4.768a 0.121 ±0.052a對(duì)照組 0.92 ±6.490b 1.12 ±5.980b 5.61 ±6.421 6.50 ±0.109 8.34 ±2.324b 0.209 ±0.125b 28 d 試驗(yàn)組 0.00 ±0.000a 0.08 ±0.020ac 5.78 ±0.863 5.99 ±1.529 2.27 ±1.920ac 0.032 ±0.040ac對(duì)照組 0.00 ±0.000b 0.96 ±0.040b 5.52 ±0.740 6.50 ±0.991 4.86 ±1.875b 0.182 ±0.037b

治療前兩組指標(biāo)(PLI、BI、PD、AL、OD、S%)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，說(shuō)明各觀測(cè)指標(biāo)均具有較好的均衡性。

在7、14、21 d時(shí)間點(diǎn)，與基線相比，兩組除PD、AL指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外(P＞0.05)，其他各項(xiàng)指標(biāo)較基線有顯著差異(P＜0.05);28 d時(shí)兩組相比，PLI、PD和AL差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。兩組相比BI、S%和OD值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。奧硝唑羧甲基殼聚糖組在降低PLI、BI的程度、減少齦下菌斑螺旋體數(shù)量S%和OD值方面均明顯優(yōu)于對(duì)照組(P＜0.05)(圖1～4)。

表2 兩組術(shù)后28 d療效評(píng)定 (n，%)

圖1 兩組臨床指標(biāo)AL，PD，BI，PLI在0～28 d的變化

圖2 兩組S%在0～28 d的變化

圖3 兩組OD值在0～28 d的變化

3 討論

齦下菌斑中細(xì)菌及其產(chǎn)物與牙周組織的破壞關(guān)系密切，牙周炎的單純機(jī)械治療協(xié)同抗菌藥物能有效抑制和殺滅牙周病原菌。與全身應(yīng)用抗生素相比，局部用藥治療牙周炎效果更好，為使抗菌藥物在牙周袋內(nèi)保持適宜濃度，并維持足夠長(zhǎng)的時(shí)間，有必要采用局部緩釋系統(tǒng)，以控制藥物濃度的降低［3］。羧甲基殼聚糖具有良好的生物相容性、降解性和細(xì)胞黏附性，且無(wú)毒、無(wú)免疫原性、高安全性，是良好的藥物載體，對(duì)臨床上一些特殊牙周炎的治療起到很好的輔助作用［4］。Tarsi等［5］發(fā)現(xiàn)，殼聚糖在口腔黏膜的附著時(shí)間可大于4 d。奧硝唑是一種窄譜抗菌素［6］，有效殺滅專性厭氧菌，而專性厭氧菌是慢性牙周炎發(fā)病初期和進(jìn)展期中主要病原體。本藥物治療方案與耿素芳等研究“鹽酸米諾四環(huán)素軟膏對(duì)齦溝液中膠原酶的影響”［7］相一致，即用藥方法注滿受試牙牙周袋，1次/周，共4次。奧硝唑用藥時(shí)間較長(zhǎng)可能引致菌群失調(diào)，本實(shí)驗(yàn)未做設(shè)置監(jiān)測(cè)耐藥菌株的指標(biāo)，有待進(jìn)一步研究。

有研究表明，慢性牙周炎患者的絕大部分位點(diǎn)，通過(guò)機(jī)械治療和定期維護(hù)可處于靜止?fàn)顟B(tài)，因?yàn)檠乐軝C(jī)械治療后牙周炎位點(diǎn)和健康位點(diǎn)齦上、齦下菌群中各種細(xì)菌的數(shù)量都明顯下降［8］，臨床癥狀明顯好轉(zhuǎn)，牙周臨床指標(biāo)均有不同程度下降。本結(jié)果顯示，試驗(yàn)組和對(duì)照組除 PD、AL外，PLI、BI、S%、OD 值均在治療后的 7、14、21、28 d 比牙周基礎(chǔ)治療(0 d)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。與周婷等報(bào)道基本一致［9］。

大量試驗(yàn)表明，牙周潔治和齦下刮治后數(shù)分鐘到數(shù)10 d牙周袋內(nèi)即有殘余細(xì)菌的再定植和繁殖，所以如不繼續(xù)干預(yù)，在治療后數(shù)周內(nèi)細(xì)菌又可達(dá)到治療前的有害水平［10］。Loesche的研究表明健康齦下螺旋體不超過(guò)1.8%，在深牙周袋中螺旋體和G－桿菌比例增加，螺旋體可高達(dá)近40%。螺旋體為G－菌，常與牙齦卟啉單胞菌、梭形桿菌等厭氧菌呈現(xiàn)混合感染，多在深牙周袋檢出［11］。奧硝唑羧甲基殼聚糖聯(lián)合應(yīng)用抑菌性能增強(qiáng)并有緩釋作用，對(duì)口腔重要厭氧菌具有較明顯的抑菌作用和良好的生物相容性［12］。刮治后牙周袋內(nèi)注入奧硝唑羧甲基殼聚糖溶膠，維持袋內(nèi)有效藥物濃度，發(fā)揮其較強(qiáng)的殺滅厭氧菌的功效［13］。本結(jié)果顯示，S%在7 d試驗(yàn)組與對(duì)照組均下降最快，之后平穩(wěn)下降。在7、14、21 d試驗(yàn)組和對(duì)照組各項(xiàng)牙周指標(biāo)比較差異無(wú)顯著性(P＞0.05);而在28 d，BI、S%和OD值差異有顯著性(P＜0.05)，表明隨著細(xì)菌的繼續(xù)定殖，奧硝唑的優(yōu)勢(shì)顯現(xiàn)出來(lái)。

BANA試驗(yàn)OD值作為牙周炎輔助診治的客觀指標(biāo)之一［14］，具有簡(jiǎn)便、快捷、敏感、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在確立牙周炎的嚴(yán)重程度和療效觀察，指導(dǎo)臨床用藥上有其重要意義。BANA試驗(yàn)是利用與牙周炎密切相關(guān)的病源微生物［牙齦卟啉單胞菌、齒密螺旋體、福塞氏類桿菌等能產(chǎn)生胰蛋白酶樣酶(TLE)，可使人工合成的酶底物—苯甲酰精氨酸萘酰胺(BANA)水解］建立的快速檢測(cè)這些細(xì)菌的方法。TLE的監(jiān)測(cè)有助于了解牙周病變的程度［15］，隨著牙周齦下病源微生物量的增加，TLE活性的增強(qiáng)，臨床檢查的各指數(shù)均呈明顯的上升趨勢(shì)［16］。TLE具有蛋白水解酶和對(duì)成纖維細(xì)胞的抑制作用，對(duì)局部組織不斷溶解、破壞導(dǎo)致血管通透性的增加，影響牙周袋上皮的完整性、連續(xù)性，是牙周組織破壞的重要因素之一［17］。本結(jié)果顯示，在牙周上藥14 d前OD值兩組下降一致，28 d時(shí)試驗(yàn)組OD值下降較對(duì)照組快，說(shuō)明奧硝唑羧甲基殼聚糖溶膠配合基礎(chǔ)治療，OD值明顯減少齦下菌斑TLE水平優(yōu)先于對(duì)照組。

PD、AL可客觀反映牙周組織破壞程度，本試驗(yàn)PD、AL在均值上略有改變，但無(wú)顯著性，可能是由于牙周袋和附著水平在28 d短時(shí)間內(nèi)變化不大所導(dǎo)致。

本結(jié)果證實(shí)了慢性牙周炎是一種由多種致病菌引起的慢性感染性疾病，用藥后28 d試驗(yàn)組較對(duì)照組牙周臨床指標(biāo)有明顯改善，但齦下菌斑中牙周致病菌卻有反彈，用藥后BANA試驗(yàn)OD值改變顯著，因此，齦下致病菌TLE水平量的變化早于臨床指標(biāo)的變化。提示BANA試驗(yàn)OD值可以作為反映牙周治療效果的指標(biāo)，刮治后注入奧硝唑羧甲基殼聚糖溶膠較基礎(chǔ)治療在控制齦下菌斑有害微生物的作用更具優(yōu)勢(shì)。

［1］Pérez－Chaparro PJ，Gracieux P，Lafaurie GI，et al.Genotypic characterization of Porphyromonas gingivalis isolated from subgingival plaque and blood sample inpositive bacteremia subjects with periodontitis［J］.J Clin Periodontol，2008，35(9):748 －753.

［2］曹文帥，鄧婧，徐全臣.幾種常見(jiàn)牙周致病菌對(duì)羧甲基殼聚糖的降解效應(yīng)［J］.中國(guó)組織工程研究，2013，17(34):6152－6158.

［3］王聃，鄧嘉胤.牙周局部緩釋型制劑的研究現(xiàn)狀及應(yīng)用進(jìn)展［J］.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2010，(14)8:1437－1441.

［4］Yilmaz S，Kut B，Gursoy H，et al.Er:YAG laser versus systemic met－ronidazole as an adjunct to nonsurgical periodontal therapy:a clini－ cal and microbiological study［J］.Photomed Laser Surg，2012，30(6):325－330.

［5］Tarsi R，Corbin B，Pruzzo C，et al.Effect of low － molcμlarweight chitosans on the adhesive properties of oral streptococci［J］.Oral Microbiol Immunol，1998 ，13(4)217 －222.

［6］Silva MP，F(xiàn)eres M，Sirotto TA，et al.Clinical and microbiological benefits of metronidazole alone or with amoxicillin as adjuncts in the treatment of chronic periodontitis:a randomized placebocontrolled clinical trial［J］.J Clin Periodontol，2011，38(9):828－837.

［7］耿素芳，曹采方，陳智濱，等.鹽酸米諾四環(huán)素軟膏對(duì)齦溝液中膠原酶的影響［J］.中華口腔醫(yī)學(xué)雜志，2000，35(5):336－339.

［8］Dougudomdacha S，Rawlinson A，Walsh TF，et al.Effect of non2s urgical periodontal treatment on clinical parameters and the num2b ers of Porphyrom onas gingivalis，Prevotella interm edia，Actinoba2c illus actinom ycetem com itans at adult periodontitis sites［J］.J Clin Periodontol，2001，28(5):437 －445.

［9］周婷，謝萍，徐屹，等.牙周基礎(chǔ)治療對(duì)慢性牙周炎患者臨床指標(biāo)及5種牙周可疑致病微生物的影響［J］.口腔醫(yī)學(xué)研究，2012，28(1):39－42.

［10］孟煥新.牙周病學(xué)［M］.北京:人民出版社，2001:213－218.

［11］Loesche WJ，Grossman N，Giordno J，et al.Meriodontitis(IV).The effect of patient compliance on treatment parameters［J］.J Clin Periodontol，1993，20(2):96 －104.

［12］徐全臣，王志國(guó)，鄧婧，等.奧硝唑緩釋生物學(xué)性能的初步觀察［J］.中國(guó)海洋生物學(xué)，2009，12，(6):451 －452.

［13］張國(guó)棟，劉魯川，劉娜，等.復(fù)方奧硝唑甲磺酸培氟沙星緩釋牙栓對(duì)大鼠齦溝液中天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平的影響［J］.口腔醫(yī)學(xué)研究，2008，24(1):36－38.

［14］閆文娟，薛毅，李向飛，等.改良固相BANA試驗(yàn)方法的建立［J］.牙體牙髓牙周病學(xué)雜志，2007，17(7):394－397.

［15］Morita M，Wang HL.Relationship between sulcular sulfide level and oral malodor in subjects with periodontal disease［J］.J Periodontol，2001，72(1):79 －84.

［16］王麗，吳亞菲，楊禾，等.不同采樣方法對(duì)齦下牙周致病菌檢出的比較研究［J］.牙體牙髓牙周病學(xué)雜志，2009，19(1):29 －31.

［17］Eckley B，Thomas J，Crout R，et al.Periodontal and microbiological status of patients undergoing orthodontic therapy［J］.J Hong Kong Dent，2012，9:11 －20.