李蓓蕾，岳陽麗，劉 瑤，劉學(xué)軍

(鄭州大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，河南鄭州 450052)

芹菜素(apigenin)又稱 5，7，4＇－ 三羥基黃酮，分子式為C15Hl0O6，不溶于水，易溶于乙醇、二甲基亞砜，是一種廣泛存在于蔬菜和水果中的天然黃酮類化合物;芹菜素具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、降血壓、抗動脈硬化、抗焦慮、保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)等藥理作用［1－2］。近年來關(guān)于芹菜素在齲病預(yù)防方面的作用也逐漸引起了人們的關(guān)注。Koo H等［3］研究發(fā)現(xiàn)，芹菜素可顯著抑制變異鏈球菌(Streptococcus mutans，S.mutans)gtfB 和 gtfC mRNA 的表達(dá)，同時還能抑制GTF B、GTF C的活性和胞外多糖的生成。本實(shí)驗通過觀察芹菜素對S.mutans的生長、粘附、產(chǎn)酸以及葡聚糖轉(zhuǎn)移酶(GTF)的活性和水不溶性胞外多糖的生成等多個致齲毒力因子的影響，進(jìn)一步探討其抗齲機(jī)制，為芹菜素這一天然化合物用于齲病預(yù)防提供實(shí)驗室依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗菌株和主要試劑

變異鏈球菌ATCC 25175(血清型C，購自四川大學(xué)口腔生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗室);芹菜素(西安飛達(dá)生物技術(shù)有限公司);TPY瓊脂培養(yǎng)基、TPY液體培養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司);無菌脫纖維蛋白血(鄭州寶賽生物技術(shù)公司);無水乙醇、蒽酮、固體硫酸銨、EDTA、葡聚糖(天津科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)和菌懸液制備

取S.mutans ATCC25175菌株，常規(guī)復(fù)蘇48 h后接種于TPY液體培養(yǎng)基，并置于37℃培養(yǎng)箱中厭氧(800 mL/L N2、100 mL/L H2、100 mL/L CO2)條件下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后離心收集細(xì)菌，并用無菌生理鹽水重懸制成菌懸液;然后用紫外分光光度計調(diào)整540 nm波長處的吸光度值(OD)為1.0，用于以下實(shí)驗。

1.2.2 含不同濃度芹菜素培養(yǎng)基的制備

取一定量的芹菜素溶解于無水乙醇中，然后再用含20 g/L蔗糖的TPY液體培養(yǎng)基以二倍稀釋法制成含芹菜素濃度分別為 400、200、100、50、25、12.5 μg/mL的含藥培養(yǎng)基;同時配制含相同體積無水乙醇而不含芹菜素的培養(yǎng)基用于溶劑對照。

1.2.3 芹菜素對S.mutans生長影響的觀察

取S.mutans菌懸液均勻涂布于TPY瓊脂培養(yǎng)板，并在其表面分別放置浸有不同濃度芹菜素的含藥培養(yǎng)基(實(shí)驗組)、1.6 mg/mL氯已定溶液(陽性對照組)、含無水乙醇不含芹菜素的TPY培養(yǎng)基(溶劑對照組)、單純TPY培養(yǎng)基(空白對照組)的圓形紙片;然后一并置于37℃培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)，24 h后取出，分別測量各組抑菌環(huán)的直徑。每組重復(fù)3次取均值。

1.2.4 芹菜素對S.mutans產(chǎn)酸能力影響的觀察

取S.mutans菌懸液0.1 mL分別接種于1 mL含藥培養(yǎng)基、溶劑對照培養(yǎng)基、單純TPY培養(yǎng)基(空白對照);充分混勻并調(diào)整pH值為7.0后，置37℃培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后，收集各組培養(yǎng)液并離心取上清;然后用數(shù)字酸度計測定各組上清液的pH值，并計算培養(yǎng)前后pH值的變化量(ΔpH)，ΔpH=初始pH值－終末pH值。每組重復(fù)測量3次，取均值。

1.2.5 芹菜素對S.mutans粘附能力影響的觀察取S.mutans菌懸液按1.2.4相同的方法分別接種于各含藥培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基;然后將各組試管與地平面呈30°置于37℃培養(yǎng)箱中，厭氧培養(yǎng)48 h后，收集各組粘附于試管壁上的細(xì)菌，測OD450nm，并按以下公式計算粘附抑制率。

1.2.6 芹菜素對S.mutans GTF活性影響的觀察

取S.mutans菌懸液按1.2.4相同的方法分別接種于各含藥培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基;37℃厭氧培養(yǎng)24 h后，收集各組培養(yǎng)液并離心取上清;然后參照文獻(xiàn)［4］報道的方法提取GTF粗酶，采用考馬斯亮藍(lán)法測定其總蛋白含量后，再用Somogyi法測定各組酶－底物反應(yīng)液中的還原糖量，并計算GTF的活力單位(IU)及其比活力。

1.2.7 芹菜素對S.mutans生成水不溶性胞外多糖影響的觀察

取1.2.6離心后保留的各組細(xì)菌沉淀物，用5 mL蒸餾水洗滌、離心2次后加入0.5 mol/L氫氧化鈉溶液洗滌、離心3次;合并上清液并用蒽酮法測定各組胞外水不溶性葡聚糖的含量［4］。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同濃度芹菜素對S.mutans生長的影響

12.5～400 μg/mL 不同濃度芹菜素對 S.mutans的生長均無抑制作用，與空白對照組相比無顯著性差異(P＞0.05);而陽性對照組(氯已定組)則有明顯的抑菌環(huán)產(chǎn)生，其直徑達(dá)16.7 mm(表1)。

表1 各組抑菌環(huán)直徑比較

2.2 不同濃度芹菜素對S.mutans產(chǎn)酸能力的影響

12.5～400 μg/mL 不同濃度芹菜素與 S.mutans共同培養(yǎng)48 h后，其培養(yǎng)上清液的pH值均較初始pH值明顯下降;各實(shí)驗組的△pH下降量，與空白對照組和溶劑對照組相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，兩對照組間也無統(tǒng)計學(xué)差異(P ＞0.05)(表2)。

表2 培養(yǎng)前后各組培養(yǎng)上清△pH比較()

表2 培養(yǎng)前后各組培養(yǎng)上清△pH比較()

各組間兩兩相比均無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)

pH芹菜素(μg/mL)組別 △12.50 3.555 ±0.04225.00 3.525 ±0.02450.00 3.540 ±0.027100.00 3.510 ±0.022200.00 3.543 ±0.022400.00 3.543 ±0.019空白對照組 3.568 ±0.028溶劑對照組3.523 ±0.036

2.3 不同濃度芹菜素對S.mutans粘附能力的影響

12.5～400 μg/mL 芹菜素與 S.mutans共同培養(yǎng)48 h后，與空白對照組和溶劑對照組相比，除12.5 μg/mL組無統(tǒng)計學(xué)差異(P ＞0.05)外，其他各濃度組的細(xì)菌粘附量均明顯下降(P＜0.05)，且隨著芹菜素濃度的升高，其粘附量越來越少，各濃度芹菜素組間兩兩相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);而兩對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)(表3)。

表3 各組細(xì)菌粘附量(OD值)及其粘附抑制率比較

2.4 不同濃度芹菜素對S.mutans GTF活性的影響

12.5～400 μg/mL 不同濃度芹菜素與 S.mutans共同培養(yǎng)24 h后，Somogyi法檢測結(jié)果顯示:各濃度芹菜素組的還原糖量、GTG酶活力以及酶比活力均明顯低于溶劑對照組和空白對照組(P＜0.05)，且隨著芹菜素濃度的增加，其還原糖量、酶活力以及酶的比活力均逐漸降低;各濃度芹菜素組間各指標(biāo)兩兩相比，除200 μg/mL組與400 μg/mL組無統(tǒng)計學(xué)差異(P ＞0.05)外，其他各濃度組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(表4)。

表4 不同濃度芹菜素對S.mutans GTF活性的影響()

表4 不同濃度芹菜素對S.mutans GTF活性的影響()

不同字母組間P＜0.05

組別 總蛋白含量(μg/mL)還原糖量(μg/mL)酶活力(mIU)比活力(mIU/μg)芹菜素 12.50 89.786 ±1.519 95.152 ±3.193a 26.431 ±0.887a 0.295 ±0.078a(μg/mL) 25.00 85.143 ±1.088 64.576 ±2.044b 17.938 ±0.568b 0.210 ±0.091b 50.00 75.607 ±1.362 30.152 ±2.068c 8.375 ±0.574c 0.121 ±0.070c 100.00 61.643 ±2.328 17.091 ±2.589d 4.748 ±0.719d 0.078 ±0.026d 200.00 49.143 ±3.803 10.667 ±0.410e 2.963 ±0.114e 0.061 ±0.013d 400.00 38.857 ±3.511 8.606 ±0.706e 2.391 ±0.196e 0.060 ±0.029d溶劑對照組 97.500 ±2.398 106.424 ±0.735f 29.562 ±0.204f 0.304 ±0.061e空白對照組 97.286 ±4.271 108.152 ±2.025f 30.042 ±0.563f 0.307 ±0.012e

2.5 不同濃度芹菜素對S.mutans生成水不溶性胞外多糖含量的影響

12.5～400 μg/mL 芹菜素與 S.mutans共同培養(yǎng)24 h后，與空白對照組和溶劑對照組相比，除12.5 g/mL組無統(tǒng)計學(xué)差異(P ＞0.05)外，其他各濃度組的水不溶性多糖的含量均明顯降低(P＜0.05)，且隨著芹菜素濃度降低的程度越來越大;各濃度組間兩兩相比，除 200 μg/mL組與400 μg/mL組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P ＞0.05)外，其他各濃度組間水不溶性胞外多糖含量的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);空白對照組與溶劑對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。不同濃度芹菜素組的GTF酶活性與水不溶性胞外多糖含量之間呈顯著正相關(guān)(r=0.935，P ＜0.05)(表5)。

表5 各組水不溶性胞外多糖含量的比較()

表5 各組水不溶性胞外多糖含量的比較()

不同字母組間P＜0.05

組別 水不溶性胞外多糖含量(μg/mL芹菜素(μg/mL)12.50 560.745 ±17.749a 25.00 441.948 ± 6.633b 50.00 372.575 ±13.163c 100.00 259.594 ±12.383d 200.00 109.720 ±15.137e 400.00 116.136 ± 8.201e溶劑對照組 553.126 ±20.301a空白對照組 549.316 ±15.185a

3 討論

芹菜素是天然存在的一種黃酮類化合物，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1所示:其中5、7、4＇位的3個羥基及C2C3雙鍵決定了其獨(dú)特的理化性質(zhì)和生物學(xué)作用。

圖1 芹菜素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

本結(jié)果顯示，12.5 ～400 μg/mL 濃度范圍的芹菜素對變鏈菌在TPY瓊脂平板上的生長均無抑菌作用，說明芹菜素作為防齲藥物不會因為抑制菌斑中S.mutans的生長而破壞微生物的平衡。

S.mutans的致齲毒力因子主要包括對牙面的粘附、產(chǎn)酸、生成 GTF和水不溶性胞外多糖。S.mutans在成熟菌斑深層的缺氧環(huán)境中主要通過糖酵解途徑分解糖而代謝產(chǎn)酸，從而使局部pH值下降，造成牙體硬組織酸蝕脫礦、有機(jī)物分解，最終導(dǎo)致齲病的形成和進(jìn)一步發(fā)展。本實(shí)驗使用數(shù)字酸度計測定芹菜素與S.mutans共同培養(yǎng)后的pH值變化發(fā)現(xiàn)，12.5～400 μg/mL不同濃度的芹菜素對S.mutans培養(yǎng)上清液的pH下降均無明顯影響，提示芹菜素不能抑制S.mutans的產(chǎn)酸。

S.mutans在牙面上粘附和定植是致齲的始動因子。本結(jié)果顯示，除12.50 μg/mL濃度的芹菜素對S.mutans的粘附無抑制作用外，其他各濃度組均能明顯抑制S.mutans的粘附能力;且其抑制作用隨著芹菜素濃度的增加而明顯增強(qiáng)，400 μg/mL組的粘附抑制率可達(dá)87.39%，提示芹菜素能有效抑制S.mutans的粘附能力。進(jìn)一步實(shí)驗還發(fā)現(xiàn)，隨著芹菜素濃度的升高，S.mutans的GTF活性及其所生成的水不溶性胞外多糖含量均呈下降的趨勢;Pearson相關(guān)性分析顯示，不同濃度芹菜素組的GTF酶活性與水不溶性胞外多糖含量之間呈顯著正相關(guān)(r=0.935，P ＜0.05)。提示，芹菜素不僅能有效抑制S.mutansGTF的活性，同時還可有效抑制S.mutans合成水不溶性胞外多糖的能力。但是，當(dāng)芹菜素濃度達(dá)到200 μg/mL時，其對GTF和水不溶性胞外多糖的抑制作用不再隨著芹菜素濃度的進(jìn)一步升高而顯著增強(qiáng)。

S.mutans的粘附經(jīng)歷兩個階段。首先是非蔗糖依賴的初始粘附，該階段中S.mutans對牙面的粘附具有選擇性;且與其胞壁中的磷脂壁酸和表面蛋白密切相關(guān)。脂磷壁酸是GTF在S.mutans細(xì)胞表面的受體，能促進(jìn)GTF結(jié)合到細(xì)胞表面，從而調(diào)節(jié)其對牙面的粘附;表面蛋白P1是較肯定的S.mutans黏結(jié)素，能與獲得性膜中受體成分發(fā)生特異性結(jié)合。推測芹菜素抑制S.mutans粘附能力的機(jī)制可能是其與S.mutans競爭性結(jié)合胞壁表面的受體和獲得性膜中受體成分，從而抑制S.mutans的初始粘附。S.mutans粘附的第二階段是蔗糖依賴性粘附，即S.mutans生成的GTF利用蔗糖合成水不溶性胞外多糖來介導(dǎo)該菌的蔗糖依賴性粘附、集聚。水不溶性胞外多糖具有很強(qiáng)的粘性和抗水解能力，并且參與菌斑基質(zhì)的組成;其不僅能構(gòu)成菌斑的基本骨架結(jié)構(gòu)，同時還能限制菌斑中有機(jī)酸的擴(kuò)散，使菌斑局部pH值下降，從而導(dǎo)致牙釉質(zhì)脫礦，形成齲損［5］。有研究認(rèn)為，芹菜素可通過抑制S.mutansgtfs基因的表達(dá)、抑制GTF和水不溶性胞外多糖的合成，而影響 S.mutans的粘附［3］。因此，芹菜素對GTF活性的抑制作用有可能是其防齲的主要機(jī)制。另外，天冬氨酸(CH2COOH)是GTF上的糖結(jié)合活性位點(diǎn)［6］，芹菜素可通過其C2C3雙鍵與天冬氨酸(CH2COOH)發(fā)生反應(yīng)，而影響GTF的活性。

綜上所述，芹菜素可抑制S.mutans的粘附、GTF活性和水不溶性胞外多糖的產(chǎn)生，具有抗菌斑、預(yù)防齲病的潛力;而且不影響S.mutans的生長及其產(chǎn)酸活動，有利于維持牙菌斑中的微生態(tài)平衡，有望開發(fā)為一種有效的防齲藥物。

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