徐 喆，倪 佳，謝寶儀，軒東英，章錦才

(南方醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院·廣東省口腔醫(yī)院，廣東廣州 510280)

據(jù)世界衛(wèi)生組織2008年公布，每年至少有280萬的成年人死于肥胖或者超重，是導(dǎo)致死亡的重要因素［1］。另據(jù)報(bào)道，牙周炎是成年人失牙的首要因素，并已成為影響我國成年人口腔健康的第一口腔疾?。?］。

有研究發(fā)現(xiàn)，代謝綜合癥可導(dǎo)致更加嚴(yán)重、迅速的牙周破壞，而牙周炎又會對全身性疾病產(chǎn)生一定的影響;因此，關(guān)于兩者之間的關(guān)系越來越受到人們的重視［3－4］。Hotamisligil等［5］(1993)首次提出了肥胖與炎癥聯(lián)系。此后許多研究也指出，脂肪組織不僅是能量的儲存器官，還是活躍的內(nèi)分泌器官［6］;脂肪的炎癥因子可能是連接肥胖、糖尿病、胰島素抵抗、動(dòng)脈粥樣硬化以及代謝綜合征的紐帶［7－8］。胰島素抵抗是 T2DM 的特征，有研究發(fā)現(xiàn)，TNF－α、白細(xì)胞介素 －1β(Interleukin，IL－1β)可通過介導(dǎo)胰島β細(xì)胞的破壞導(dǎo)致胰島素抵抗［9－10］;而 IL－1β 受體拮抗劑及 IL－1β 抗體均可治療 T2DM［11－13］。牙周炎，是以牙周支持組織破壞為特征的慢性炎癥性疾病。牙周炎部位齦溝液中的IL－1β和TNF－α濃度均高于牙周正常部位，而治療后其濃度則有所下降;提示牙周炎的炎癥程度增加以及預(yù)后與 IL－1β的濃度增加有關(guān)［4，12.14－15］。牙周炎與肥胖相關(guān)性研究認(rèn)為，牙周炎的發(fā)展除了與糖尿病患者的糖化血紅蛋白、血糖水平控制不良有關(guān)外，還與體質(zhì)量指數(shù)(Body Mass Index，簡稱BMI，體質(zhì)量公斤除以身高米的平方)的增加密切相關(guān);而且肥胖還有可能影響牙周炎的治療效果，并導(dǎo)致更加嚴(yán)重的牙槽骨喪失［16－19］。牙周炎與全身疾病相關(guān)性研究指出，過高表達(dá)的炎癥因子可能會影響全身性疾病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展［11］。本實(shí)驗(yàn)通過觀察肥胖復(fù)合牙周炎大鼠牙齦組織和血清中的TNF－α及IL－1β表達(dá)水平，及其與胰島素抵抗的關(guān)系，探討牙周炎對肥胖機(jī)體胰島素抵抗影響的可能機(jī)制。

1 .材料和方法

1.1 主要材料、試劑和儀器

SPF級新生SD大鼠［中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號:SYXK(粵)2007－0081］;0.01 mol/L PBS 緩 沖 液 (pH7.2 ～ 7.4)、0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0)、水溶性封片劑 clearmount、固紅、AP－red(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);多聚賴氨酸防脫片載玻片(北京世泰有限公司);兩步法鼠兔通用免疫組化染色二抗試劑盒、濃縮型DAB顯色試劑盒(DAKO生物技術(shù)有限公司);生物素化SABC抗鼠三步法試劑盒、白細(xì)胞介素－1β抗體、腫瘤壞死因子－α抗體(武漢博士德生物工程有限公司);pH測試儀(PHSJ－3F，上海精科);磁力恒溫?cái)嚢杵?IKA，德國);電子天平0.0001g(BP110S，Sartorius，德國);恒溫孵箱(Heraeus，德國);可調(diào)移液器(Eppendorf，德國);超低溫冰箱(Sanyo，日本);倒置顯微鏡(Olypus，日本);低溫離心機(jī)(Thermo，美國);超純水機(jī)(Milli－QUltra－Pure，Millipore，Billerica，MA，德國)。

1.2 方法

1.2.1 肥胖復(fù)合牙周炎動(dòng)物模型的建立

取健康新生SD大鼠32只(均為雄性)，隨機(jī)分為正常對照(C)組、牙周炎(CP)組、肥胖(OB)組、肥胖復(fù)合牙周炎(OB+CP)組，共4組，每組8只。C組各大鼠不施加任何干預(yù)措施用于對照。CP組各大鼠于12周齡時(shí)分別在100 g/L水合氯醛腹腔注射(0.3 mL/100 g)麻醉下，用0～3號絲線(泰絲)結(jié)扎其左、右上頜第一、二磨牙頸部(結(jié)扎絲盡量置于齦溝內(nèi));同時(shí)在齦溝內(nèi)涂布牙齦卟啉單 胞 菌 (Porphyromonas gingivalis，Pg)ATCC33277、伴放線嗜血桿菌(Hctinobacillus actinomycetemcomitans，Ha)ATCC29523、中間普氏菌(Prevotella intermedia，Pi)ATCC25611、具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum，F(xiàn)n)ATCC255864種主要牙周致病菌的混合菌懸液(109CFU/mL)，建立牙周炎模型。OB組各大鼠分別于出生后第2、4、6、8、10 天，皮下注射谷氨酸鈉(sigma，3 mg/kg)建立肥胖模型。OB+CP組各大鼠按OB組的方法建立肥胖模型后，再于12周時(shí)按CP組的方法結(jié)扎左右上頜第一、二磨牙頸部，建立肥胖復(fù)合牙周炎模型。各組所有大鼠均于出生后21 d斷乳，單籠普通飼料(無菌真空包裝，廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)飼養(yǎng);自由攝食和飲水。

建模期間，每天觀察大鼠活動(dòng)、攝食、排泄等情況;并分別于實(shí)驗(yàn)第0天及處死前由2名實(shí)驗(yàn)人員用電子秤分別稱量各組動(dòng)物體質(zhì)量2次，取平均值。

1.2.2 ELISA法檢測各組大鼠血清中 TNF－α、IL－1β的水平

建模結(jié)束后取各大鼠的血清，用免疫酶聯(lián)吸附反應(yīng)(ELISA)法檢測血清中TNF－α及IL－1β的水平。ELISA具體步驟:取出酶標(biāo)板分別將標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)記有編號的各樣品各100 μL依次加入空白微孔中;然后在標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔中各加入50 μL的酶標(biāo)記溶液，(36±2)℃條件進(jìn)行孵育;60 min后用PBS清洗5次(每次靜置10～20 s)，并分別于每孔加入底物 A、B 液各 50 μL，(36±2)℃避光孵育15 min;每孔加入50 μL終止液終止反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀分別測各孔450 nm波長處的吸光度值(OD值)。以標(biāo)準(zhǔn)品OD值/標(biāo)準(zhǔn)品0點(diǎn)OD值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線;然后根據(jù)各樣品OD值即可在曲線上查到對應(yīng)的TNF－α和IL－1β濃度值。

1.2.3 免疫組化檢測各大鼠牙周組織中TNF－α、IL－1β 的表達(dá)

建模結(jié)束后處死所有大鼠，分別取其上頜第一、二磨牙牙齦組織，并常規(guī)制備石蠟切片;然后采用免疫組化 Envision二步法檢測 TNF－α以及IL－1β的蛋白表達(dá)水平。具體方法:切片置60°C恒溫箱中烤片2 h后，常規(guī)脫蠟至水;30 mL/L過氧化氫孵育10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性;PBS洗5 min×3次，滴加枸椽酸鹽溶液微波修復(fù)抗原(高火 6 min，中低火 7 min);PBS洗5 min×3次，滴加稀釋的一抗，4°C過夜;PBS洗5 min×3次，滴加二抗工作液，37℃孵育20 min;PBS洗5 min×3次，顯色劑DAB顯色;自來水充分漂洗終止顯色后，透明、蘇木精復(fù)染、封片，顯微鏡下觀察。陰性對照組以PBS液代替一抗，其余步驟相同。結(jié)果判定:TNF－α以及IL－1β陽性染色為棕褐色、定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。采集各組圖像，并用圖像分析系統(tǒng)計(jì)算其光密度值作為TNF－α和IL－1β蛋白的相對表達(dá)量。

1.2.4 計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)HOMA－IR

于大鼠處死前，禁食12 h，剪尾法取血，檢測大鼠空腹血糖(強(qiáng)生豪穩(wěn)微量血糖儀)值;取血清，免疫酶聯(lián)吸附反應(yīng)法(ELISA法)檢測并記錄空腹血清胰島素表達(dá)水平，計(jì)算方法如下。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組血清TNF－α水平比較及其與胰島素抵抗的相關(guān)性

各組大鼠血清 TNF－α水平以正常對照組(C組)最低，OB+CP組最高，由低到高依次為:C 組(33.952±6.990)＜CP 組(42.800±7.452)＜OB組(49.356±3.159)＜OB+CP組(85.036±9.532)，各組間兩兩相比，除OB組與CP組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)外，其余各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);干預(yù)主效應(yīng)及其相互作用分析顯示:牙周炎(F=77.275，P=0.000)與肥胖(F=129.489，P=0.000)兩處理因素對于機(jī)體血清TNF－α水平的升高具有協(xié)同交互作用(F=28.061，P=0.000)(表 1)。

各組HOMA－IR評分以O(shè)B+CP組最高，依次為:OB+CP組＞OB組＞CP組＞C組;相關(guān)性分析顯示，血清 TNF－α水平與胰島素抵抗指數(shù)(HOMA－IR)呈正相關(guān)(r=0.854)(圖1)。

表1 各組血清TNF－α水平(ng/mL)比較(n=8，)

表1 各組血清TNF－α水平(ng/mL)比較(n=8，)

*主效應(yīng)的F統(tǒng)計(jì)量和P值;#交互效應(yīng)的F統(tǒng)計(jì)量和P值

項(xiàng)目 CP(+) CP(－) Sum F/t P OB(+)85.036 ± 9.53249.356 ±3.15967.196 ±19.660 10.049 0.000 OB(－ )42.800 ± 7.45233.952 ±6.99038.376 ± 8.342 2.449 0.028 Sum 63.918 ±23.32441.654 ±9.52552.786 ±20.858 77.275* 0.000*F/t P 9.8730.0005.6800.000129.489*0.000* (F=28.061，P=0.000)#

圖1 血清TNF－α水平與HOMA－IR相關(guān)性分析

2.2 各組血清IL－1β水平比較及其與胰島素抵抗的相關(guān)性

各組大鼠血清IL－1β水平以正常對照組(C組)最低，OB+CP組最高，由低到高依次為:C組(55.733±7.585)＜OB 組(65.238 ±5.959)＜ CP 組(68.245 ±7.060)＜ OB+CP 組(108.512 ±8.732)，各組間相比，除OB組與CP組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)外，其余各組間均有顯著差異(P＜0.05);干預(yù)主效應(yīng)及相互作用分析顯示:牙周炎(F=113.630，P=0.000)與肥胖(F=90.460，P=0.000)兩處理因素對于機(jī)體血清IL－1β水平的升高具有協(xié)同交互作用(F=34.519，P=0.000)(表2)。各組 HOMA－IR 評分顯示以O(shè)B+CP組最高，依次為:OB+CP組＞OB組＞CP組＞C組;血清IL－1β水平與胰島素抵抗指數(shù)(HOMA－IR)呈正相關(guān)(r=0.730)(圖2)。

表2 各組血清IL－1β水平(ng/mL)比較(n=8，)

表2 各組血清IL－1β水平(ng/mL)比較(n=8，)

*主效應(yīng)的F統(tǒng)計(jì)量和P值;#交互效應(yīng)的F統(tǒng)計(jì)量和P值

項(xiàng)目 CP(+) CP(－) Sum F/t P OB(+)108.512 ± 8.73265.238 ±5.959 86.875 ±23.484 11.577 0.000 OB(－) 68.245 ± 7.060 55.723 ±7.585 61.984 ± 9.587 3.417 0.000 Sum 88.378 ±22.164 60.481 ± 8.220 74.430 ±21.708113.630* 0.000*F/t P 10.1420.0002.7900.00090.460*0.000* (F=34.519，P=0.000)#

圖2 血清IL－1β水平與HOMA－IR相關(guān)性分析

2.3 各組牙齦組織中TNF－α和IL－1β的表達(dá)水平

與正常對照組相比，CP組和OB+CP復(fù)合組牙齦組織中的 TNF－α、IL－1β水平均顯著升高(P＜0.05)，其中以CP組升高最明顯，與OB+CP組相比，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);OB組牙齦組織中的TNF－α和IL－1β水平均較正常對照組略有下降(P＞0.05)，分別與單純CP組，OB+CP復(fù)合組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖3～4)。

圖3 各組大鼠牙齦組織中TNF－α相對表達(dá)量比較

圖4 各組大鼠牙齦組織中IL－1β相對表達(dá)量比較

3 討論

近20年間，肥胖在全球各發(fā)達(dá)國家以及發(fā)展中國家的發(fā)病率均在逐年上升，加之其有可能導(dǎo)致糖尿病、心血管疾病以及胰島素抵抗等多種影響全身健康的并發(fā)癥，而越來越受到人們的廣泛關(guān)注。此外，肥胖還與多種口腔疾病尤其是牙周病有關(guān);而牙周炎和肥胖又均與多種炎癥相關(guān)因子的慢性分泌有關(guān)，兩者有著共同的病理機(jī)制［20－24］。

本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，CP組、OB組以及OB+CP組血清中的TNF－α、IL－1β的表達(dá)水平均較正常對照組顯著升高。其中以O(shè)B+CP組升高的幅度最大，與其他模型組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。析因方差分析顯示，牙周炎和肥胖兩處理因素對大鼠血清的TNF－α、IL－1β升高有協(xié)同效應(yīng)作用;而TNF－α、IL－1β水平又與抵抗指數(shù)呈正相關(guān)。提示，牙周炎可能通過促進(jìn)相關(guān)炎癥因子分泌而影響肥胖機(jī)體胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展，分析可能機(jī)制如下:①肥胖狀態(tài)下，脂肪組織分泌的炎癥因子可導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生一系列的“瀑布級聯(lián)反應(yīng)”，從而使相應(yīng)的炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，本課題組前期的研究曾發(fā)現(xiàn)，牙周炎能促進(jìn)肥胖機(jī)體脂肪組織中巨噬細(xì)胞的集聚［24］;②牙周炎相關(guān)致病微生物及其產(chǎn)物可刺激牙周組織產(chǎn)生高濃度的炎癥因子，并通過破潰的牙齦上皮進(jìn)入血循環(huán)，從而提高了血清中炎癥因子的水平;③細(xì)菌相關(guān)產(chǎn)物進(jìn)入血液循環(huán)后，可通過與巨噬細(xì)胞表面的TLR4結(jié)合而激活NF－κB信號通路，然后再進(jìn)一步激活相關(guān)炎癥基因的表達(dá)，并通過復(fù)雜的相關(guān)機(jī)制促進(jìn)炎癥反應(yīng)以及IR的發(fā)生［25－26］。

本結(jié)果顯示:OB組牙齦組織中的 TNF－α、IL－1β水平均較正常對照組有所下降，但無顯著差異;OB+CP組牙齦組織中的 TNF－α、IL－1β水平雖較正常對照組顯著升高，但明顯低于CP組。提示，可能與肥胖狀態(tài)下機(jī)體的固有免疫機(jī)制受損，從而使得局部組織對炎癥反應(yīng)水平降低有關(guān)。TNF－α是目前已知且公認(rèn)的參與胰島素抵抗的重要炎癥因子［27］，也是牙周炎發(fā)生發(fā)展的重要炎癥指標(biāo)。肥胖時(shí)，脂肪組織分泌的大量TNF－α不僅能降低胰島素的敏感性，而局部組織中升高的TNF－α還可通過激活破骨細(xì)胞而導(dǎo)致骨吸收［28］，從而加快了牙周炎的進(jìn)程。IL－1β是胰島素抵抗中的關(guān)鍵因子，與胰島素抵抗、細(xì)胞因子產(chǎn)生以及炎癥信號通路激活等密切相關(guān)。有研究顯示，牙周炎狀態(tài)時(shí)，局部組織和血清的IL－1β濃度均高于健康對照者;升高的IL－1β不僅含影響代謝綜合癥的進(jìn)程，還可能影響遠(yuǎn)處的重要器官、組織，并使其產(chǎn)生相應(yīng)的病理、生理學(xué)變化［29－30］。

本結(jié)果提示，在肥胖機(jī)體中，牙周炎可能通過促進(jìn)其血清中TNF－α及IL－1β的分泌而加劇胰島素抵抗的發(fā)生、發(fā)展;在不肥胖機(jī)體中，牙周炎雖可在一定程度上增加了牙齦局部組織以及血清中炎癥因子的表達(dá)，但尚不足以引發(fā)機(jī)體發(fā)生胰島素抵抗。因而，牙周健康的維護(hù)對于伴隨有肥胖且有慢性炎癥狀態(tài)的人群更具有重要的意義。

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