錢立娜，楊玉梅，覃建民，應(yīng) 康，徐繼輝，張長在

(1.內(nèi)蒙古國際蒙醫(yī)醫(yī)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010065;2.包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014060)

“贊丹-3湯散”是由白檀香、廣棗、肉豆蔻等組成的傳統(tǒng)蒙藥制劑，為蒙醫(yī)治療心血管系統(tǒng)疾病的常用藥劑，療效顯著，在內(nèi)蒙古各族人民、特別是廣大牧民中廣泛應(yīng)用。但其作用機制尚不明確，且傳統(tǒng)散劑加工很粗糙，不利于吸收，對于消化功能不良者其藥效受到影響;同時傳統(tǒng)的簡單粉碎工藝，對其中所含的芳香揮發(fā)性有效成分造成散失，影響療效。目前對贊丹-3湯散進行劑型改革，將其制成了大滴丸。本實驗擬觀察贊丹-3湯滴丸對結(jié)扎大鼠冠狀動脈所致急性心肌缺血及缺血性心律失常的保護作用并初步探討其作用機制，為其臨床應(yīng)用提供藥理學(xué)實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 由內(nèi)蒙古大學(xué)實驗動物研究中心提供的健康Wistar大鼠 (清潔級)，動物許可證號 SCXK(蒙)2002-0001。

1.2 藥品 贊丹-3湯滴丸內(nèi)容物 (由湛江海洋大學(xué)理學(xué)院提供，批號080501，臨用時用蒸餾水配成所需質(zhì)量濃度的混懸液);復(fù)方丹參片 (北京同仁堂制藥廠，批號8121180);紅四氮唑染色劑 (北京化學(xué)試劑公司，批號20080306);超氧化物歧化酶試劑盒 (南京建成生物工程研究所，批號20080410);丙二醛試劑盒 (南京建成生物工程研究所，批號20080412);一氧化氮試劑盒 (南京建成生物工程研究所，批號20080415);肌酸激酶試劑盒 (南京建成生物工程研究所，批號20080408);NF-κB p65試劑盒 (北京百奧泰斯公司，批號20080524)。

1.3 儀器 BL-420型生物機能系統(tǒng) (成都盟泰科技有限公司);DH-140型動物人工呼吸機 (浙江醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)儀器實驗廠);BI-2000型醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng) (盟泰科技公司);DZKM型電子恒溫水浴鍋 (北京市光明醫(yī)療儀器廠);721-B型分光光度計 (上海第三分析儀器廠);離心機 (北京醫(yī)療儀器修理廠)。

2 方法

2.1 動物分組 健康Wistar大鼠60只，雌雄各半，平均體質(zhì)量 (220±60)g，隨機分為:假手術(shù)組 (生理鹽水0.02 L/kg)，缺血模型組 (生理鹽水0.02 L/kg);復(fù)方丹參組 (0.3 g/kg);贊丹-3湯滴丸組 (0.3、0.15、0.075 g/kg)劑量組。所有大鼠均以0.02 L/kg灌胃給藥32 d，1次/日，于末次給藥30 min后制備模型。實驗期間各組動物一般情況良好，無死亡，實驗開始與結(jié)束各組大鼠體質(zhì)量差別均無顯著性。

2.2 模型制備［1-2］以3%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，針形電極插入肢體皮下通過BL-420生物機能系統(tǒng)記錄正常Ⅱ?qū)碾妶D。在人工呼吸機輔助下，于胸骨左側(cè)第3～4肋間開胸，剪開心包膜擠出心臟，用0號線結(jié)扎冠狀動脈左前降支 (假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎)，迅速將心臟送回胸腔，縫合胸壁。

2.3 檢測指標(biāo) 記錄缺血前心電圖及缺血30 min內(nèi)心律失常發(fā)生時間、持續(xù)時間、室顫發(fā)生率;模型制備成功5 h后，取血制備血清，嚴(yán)格按照說明書測定 SOD、MDA、CK、NO的活性及水平;取出心臟，將左室切成相等厚度的5片，用1%TTC溶液37℃恒溫水浴染色20 min，未壞死區(qū)為暗紅色，壞死區(qū)呈白色，將壞死區(qū)和非壞死區(qū)分別稱重，計算壞死區(qū)占左心室質(zhì)量的百分比，即梗死范圍;將心肌組織進行固定、包埋，進行常規(guī)切片，HE染色觀察心肌細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)改變;免疫組化染色檢測NF-κB p65的活性表達，用BI-2000圖像分析系統(tǒng)對其陽性細胞檢測分析。

2.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用統(tǒng)計軟件SPSS 11.5進行數(shù)據(jù)處理分析。統(tǒng)計數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 ()表示，計量資料組間比較用LSD－t檢驗，計數(shù)資料用χ2檢驗，P＜0.05差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 贊丹-3湯滴丸對大鼠急性缺血性心律失常的作用 各組大鼠 (除假手術(shù)組)造模后30 min內(nèi)心律失常的發(fā)生率為100%，主要表現(xiàn)為室性心律失常，多與竇性心律交替出現(xiàn)，可逐漸恢復(fù)為竇性心律。復(fù)方丹參組及贊丹-3湯滴丸0.30、0.15 g/kg組與缺血模型組比較，能明顯延遲心律失常發(fā)生時間，并縮短心律失常持續(xù)時間，降低室顫發(fā)生率 (P＜0.05或P＜0.01);贊丹-3湯滴丸0.075 g/kg組亦顯示此趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05)，見表1。

表1 贊丹-3湯滴丸對大鼠急性心肌缺血心律失常的影響(，n=10)

表1 贊丹-3湯滴丸對大鼠急性心肌缺血心律失常的影響(，n=10)

注:與假手術(shù)組比較，#P＜0.05;與缺血模型組比較，*P＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別 劑量/(g·kg －1)心律失常發(fā)生時間/min心律失常持續(xù)時間/min室顫發(fā)生率/%假手術(shù)組 －00 0缺血模型組 － 5.72±1.44# 13.23±3.64# 90#贊丹-3湯滴丸 0.300 9.76±2.47＊＊ 9.70±3.17＊＊ 20＊＊0.150 7.97 ±2.35* 10.20 ±3.85* 30＊＊0.075 6.74±2.84 11.17±2.57 70復(fù)方丹參組 0.300 10.14±2.86＊＊ 8.80±1.85＊＊ 10＊＊

3.2 贊丹-3湯滴丸對缺血5 h后大鼠血清中SOD、NO、CK、MDA的影響 贊丹-3湯滴丸各劑量組和復(fù)方丹參組與缺血模型組比較均可提高血清中SOD和NO水平 (P＜0.05或P＜0.01)，并降低MDA水平和CK活性 (P＜0.05或P＜0.01)，見表2。

表2 贊丹-3湯滴丸對大鼠心肌缺血時血清SOD、MDA、CK、NO的影響 (，n=10)

表2 贊丹-3湯滴丸對大鼠心肌缺血時血清SOD、MDA、CK、NO的影響 (，n=10)

注:與假手術(shù)組比較，#P＜0.05;與缺血模型組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 劑量/(g·kg－1)T-SOD/(U·mL －1)MDA/(nmol·mL － 1)CK/(U·mL －1)NO/(μmol·L －1)157.1±15.8 9.9±2.2 1.43±0.43 48.9±14.3缺血模型組 － 130.9±16.1# 16.1±4.8# 2.13±0.53# 29.1±8.7#贊丹-3湯滴丸組 0.300 156.4±11.4＊＊ 10.8±2.6＊＊ 1.54±0.37＊＊ 44.2±12.2＊＊0.150 155.1±10.4＊＊ 11.9±4.1* 1.51±0.43＊＊ 42.1±12.6*0.075 149.6±12.4* 12.1±4.1* 1.67±0.42* 40.3±13.6*復(fù)方丹參組 0.300 154.9±18.8＊＊ 10.7±3.5＊＊ 1.58±0.45＊＊ 41.1±12.1假手術(shù)組 －*

3.3 贊丹-3湯滴丸對大鼠心肌梗死范圍的影響 贊丹-3湯滴丸0.30、0.15 g/kg劑量組和復(fù)方丹參組與缺血模型組比較均可使心肌梗死范圍縮小 (P＜0.05或P＜0.01)，贊丹-3湯滴丸0.075 g/kg組也有此趨勢 (P＞0.05)，見表3。

表3 贊丹-3湯滴丸對大鼠心肌缺血心肌梗死范圍的影響(，n=10)

表3 贊丹-3湯滴丸對大鼠心肌缺血心肌梗死范圍的影響(，n=10)

注:與假手術(shù)組比較，#P＜0.05;與缺血模型組比較，*P＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別 劑量/(g·kg－1) 心肌梗死范圍/%假手術(shù)組 －0缺血模型組 － 23.79±7.70#贊丹-3湯滴丸組 0.300 15.19±5.82＊＊0.150 17.59±5.72*0.075 20.47±6.77復(fù)方丹參組 0.300 14.47±4.67＊＊

3.4 贊丹-3湯滴丸對大鼠心肌細胞結(jié)構(gòu)的影響 病理結(jié)果顯示，假手術(shù)組心肌纖維排列整齊，無明顯變性、壞死等病理改變;缺血模型組出現(xiàn)心肌纖維嚴(yán)重破壞，排列紊亂、溶解、斷裂;復(fù)方丹參組心肌細胞排列較紊亂，心肌纖維有散在的空泡，少數(shù)肌間隙增寬，炎性細胞浸潤;贊丹-3湯滴丸0.30 g/kg劑量組心肌纖維排列尚整齊，橫紋清晰，間質(zhì)輕度水腫，少量炎性細胞浸潤;贊丹-3湯滴丸0.15 g/kg劑量組，心肌細胞排列略稀疏，橫紋較清晰，間質(zhì)可見擴張血管，少量炎細胞浸潤，心肌間質(zhì)輕度水腫;贊丹-3湯滴丸0.075 g/kg劑量組心肌細胞排列較紊亂，間質(zhì)可見血管擴張及炎細胞浸潤，心肌間質(zhì)水腫。

3.5 贊丹-3湯滴丸對大鼠心肌缺血5h后NF-κB p65蛋白表達的影響 免疫組化結(jié)果顯示，假手術(shù)組心肌組織中NF-κB p65蛋白表達極少，且定位于胞漿;模型組中NF-κB p65蛋白的表達量明顯上升，細胞漿及細胞核內(nèi)均明顯增多;復(fù)方丹參組和贊丹-3湯滴丸各劑量組與模型組比較均有不同程度的NF-κB p65蛋白表達下降。

缺血模型組與假手術(shù)組比較，NF-κB p65蛋白表達明顯升高 (P＜0.01);復(fù)方丹參組和贊丹-3湯滴丸各劑量組與缺血模型組比較，可明顯降低心肌組織NF-κB p65蛋白的表達 (P＜0.01)，具有統(tǒng)計學(xué)意義 (見表4)。

表4 贊丹-3湯滴丸對大鼠心肌缺血損傷后NF-κB P65蛋白的影響 (，n=10)

表4 贊丹-3湯滴丸對大鼠心肌缺血損傷后NF-κB P65蛋白的影響 (，n=10)

注:與假手術(shù)組比較，#P＜0.05;與缺血模型組比較，*P＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別 劑量/(g·kg－1) 陽性細胞數(shù)/個3.90±1.66缺血模型組 － 25.80±4.47#贊丹-3湯滴丸組 0.300 13.20±3.97＊＊0.150 15.10±5.60*0.075 18.10±5.38*復(fù)方丹參組 0.300 11.70±1.77假手術(shù)組 －＊＊

4 討論

冠狀動脈左前降支是左心供血的最主要血管，若此血管栓塞使血供急劇減少或中斷，相應(yīng)心肌會造成嚴(yán)重的損傷。通常在栓塞1 h內(nèi)極易發(fā)生心律失常，最嚴(yán)重可發(fā)生室顫。本研究在贊丹-3湯滴丸藥物干預(yù)下，采用結(jié)扎大鼠冠狀動脈左前降支制備急性心肌缺血模型，觀察對大鼠急性缺血性心律失常發(fā)生的影響。結(jié)果顯示贊丹-3湯滴丸能顯著延遲急性心肌缺血所致心律失常發(fā)生時間，縮短心律失常持續(xù)時間，降低室顫發(fā)生率，能有效對抗急性缺血性心律失常的發(fā)生。

目前有研究表明［3-11］，急性心肌缺血的損傷重要機制之一是氧自由基產(chǎn)生增加，氧自由基主要是通過產(chǎn)生過氧化反應(yīng)從而影響細胞代謝，甚至引起細胞死亡。氧自由基還可以與生物膜上的脂類物質(zhì)反應(yīng)形成多種脂質(zhì)過氧化物，引起膜的流動性和通透性發(fā)生改變，使細胞膜的功能受損，加劇心肌損傷。因此目前應(yīng)用藥物干預(yù)減輕氧自由基對心肌細胞的損害，成為保護心肌損傷的重要研究方向。本研究結(jié)果顯示贊丹-3湯滴丸可明顯降低急性心肌缺血大鼠血清中MDA水平和CK活性，提高SOD活性和NO水平，從而抑制了氧自由基的產(chǎn)生，同時也增強內(nèi)源性氧自由基清除功能，表明可通過提高機體抗氧化能力，抑制脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物形成，改善心肌組織的能量代謝，達到保護心肌缺血損傷的作用。

有研究表明［12-15］，NF-κB廣泛存在于血管內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞及心肌細胞中，在機體的免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、重要臟器缺血損傷及細胞凋亡中發(fā)揮著及其重要的作用，參與冠心病的發(fā)生與發(fā)展。心肌缺血激活的NF-κB有2種形式，p50-p65異二聚體和p50-p50同二聚體。其中p50-p50沒有轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域，而p50-p65的轉(zhuǎn)錄可激活促炎因子的基因轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)炎性反應(yīng)及細胞凋亡的發(fā)生，對缺血心肌造成嚴(yán)重的損傷。本研究顯示預(yù)防性給予贊丹-3湯滴丸能明顯降低細胞NF-κB p65活性表達，表明抑制NF-κB p65的活性可能是贊丹-3湯滴丸保護急性心肌缺血損傷的重要機制。實驗中對大鼠缺血心肌進行梗死范圍檢測及病理切片觀察心肌細胞結(jié)構(gòu)變化同樣提示預(yù)防性給予贊丹-3湯滴丸能顯著減輕缺血心肌組織結(jié)構(gòu)的損傷程度。

5 結(jié)論

綜上所述，贊丹-3湯滴丸預(yù)防性干預(yù)能使急性心肌缺血組織細胞損傷明顯減輕，急性缺血性心律失常發(fā)生明顯減少，對急性心肌缺血損傷具有效的保護作用。

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