閆德祺，劉永琦，2，3*，李應(yīng)東，李 豆，藺興遙，伍志偉，顏春魯

(1.甘肅中醫(yī)學(xué)院系統(tǒng)生物學(xué)與中醫(yī)藥轉(zhuǎn)化研究所，甘肅蘭州 730020;2.甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)室，甘肅蘭州 730020;3.敦煌醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730020)

惡性腫瘤嚴(yán)重危害人們的生命健康，患者死亡率高。惡性腫瘤在中醫(yī)學(xué)中多屬積的范疇，按發(fā)病進(jìn)展分為氣滯血阻、瘀血內(nèi)結(jié)、正虛瘀結(jié)3個(gè)證型，分別予以理氣通絡(luò)、活血消積;祛瘀軟堅(jiān)、調(diào)理脾胃;補(bǔ)益氣血、活血化瘀。當(dāng)歸貝母苦參丸首見(jiàn)于《金匱要略·婦人妊娠病脈證并治第二十》，該方由當(dāng)歸、貝母、苦參三味藥物組成，具有養(yǎng)血和血、清熱燥濕、化痰散結(jié)、利竅開(kāi)閉之功效。現(xiàn)代醫(yī)家將當(dāng)歸貝母苦參丸運(yùn)用于肺癌、膀胱癌、前列腺癌、宮頸癌等疾病的治療中，取得了較好的臨床療效［1，2］。本課題研究了當(dāng)歸貝母苦參丸對(duì)KM小鼠皮下移植瘤的抑瘤作用及對(duì)順鉑化療的增效減毒作用，檢測(cè)了荷瘤小鼠血清中的低氧誘導(dǎo)因子(Hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α)水平和乳酸脫氫酶 (lactate dehydrogenase，LDH)的活力。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)昆明小鼠100只，雌雄各半，體質(zhì)量20～22 g，由甘肅中醫(yī)學(xué)院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供;動(dòng)物合格證號(hào) SCXK(甘)2011-0001;SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施使用證號(hào) SYXK(甘)2011-0001。

1.2 細(xì)胞株 H22肝癌瘤株由甘肅中醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合研究所傳代培養(yǎng)。

1.3 藥物與試劑 CO2培養(yǎng)箱 (法國(guó)NAPCO公司)，RPMI1640(美國(guó) Invitro公司);順鉑注射液，10 mg/支，齊魯制約有限公司 (批號(hào)201002CF);HIF-1α試劑盒，上海源葉生物科技有限公司 (批號(hào)20121001A);LDH試劑盒，南京建成生物工程研究所 (批號(hào)20121011)。當(dāng)歸貝母苦參丸為自制湯劑 (每1 mL藥液相當(dāng)于0.45 g生藥，當(dāng)歸、貝母、苦參各0.15 g/mL)。

1.4 儀器 SW-CJ-IF超凈臺(tái) (中國(guó)蘇州凈化設(shè)備廠);電子天平 (LD100001，龍騰電子有限公司);Abacus Junior vet 5動(dòng)物血清分析儀 (蘭橋醫(yī)療);酶標(biāo)儀 (680型，美國(guó)BD-RAD公司);UV1101紫外-可見(jiàn)分光光度儀 (上海天美科學(xué)有限公司)。

2 方法

2.1 當(dāng)歸貝母苦參丸湯劑的制備 將當(dāng)歸、貝母、苦參飲片各15 g放在陶土藥鍋中，加500 mL去離子水浸泡30 min，煎藥1 h，將藥液倒入燒杯中，再加500 mL去離子水浸泡30 min，煎藥1 h，將兩次煎出液混合后在水浴鍋中水浴加熱濃縮到100 mL，高壓滅菌。藥物質(zhì)量濃度按生藥量計(jì)算為0.45 g/mL。

2.2 動(dòng)物模型制備 KM小鼠適應(yīng)環(huán)境4 d后，按隨機(jī)數(shù)字表法分出雌雄各8只，設(shè)為正常對(duì)照組，其他小鼠造模。取傳代9 d的腹水型 H22小鼠腹水離心棄上清，用生理鹽水調(diào)至細(xì)胞密度為2×106個(gè)/mL。將H22肝癌細(xì)胞懸液 0.2 mL接種于昆明小鼠右前腋皮下，細(xì)胞計(jì)數(shù)約為4×105個(gè)，以出現(xiàn)皮丘為皮下接種部位正確。觀察小鼠接種部位的腫瘤生長(zhǎng)情況5～7 d，接種部位可觸及結(jié)節(jié)為接種成功［3］。

2.3 模型動(dòng)物分組及處理 第8天剔除接種不成功的小鼠［3］，隨機(jī)挑選接種成功的小鼠，雌雄各32只隨機(jī)分為模型對(duì)照組、順鉑組、當(dāng)歸貝母苦參丸組和當(dāng)歸貝母苦參丸加順鉑組，每組雌雄各8只。分組后稱(chēng)定質(zhì)量，模型對(duì)照組灌胃和腹腔注射生理鹽水0.4 mL/20 g，0.2 mL/20 g;順鉑組灌胃生理鹽水0.4 mL/20 g，以2.0 mg/(kg·d)腹腔注射順鉑0.2 mL/20 g;當(dāng)歸貝母苦參丸組以9 g/(kg·d)灌胃0.4 mL/20 g當(dāng)歸貝母苦參丸藥液，腹腔注射生理鹽水0.4 mL/20 g;當(dāng)歸貝母苦參丸加順鉑組以9 g/(kg·d)灌胃當(dāng)歸貝母苦參丸藥液，腹腔注射2.0 mg/(kg·d)順鉑0.2 mL;連續(xù)給藥14 d。

2.4 指標(biāo)檢測(cè)

2.4.1 小鼠一般狀態(tài)觀察及計(jì)算 觀察小鼠生存狀態(tài)，記錄小鼠的神態(tài)、發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)、活動(dòng)、飲食、二便等，反映小鼠的一般情況。記錄開(kāi)始給藥第1天和處死時(shí)的體質(zhì)量，計(jì)算治療前后的體質(zhì)量變化。體質(zhì)量變化=處死時(shí)的體質(zhì)量-分組給藥時(shí)的體質(zhì)量。有效體質(zhì)量變化=處死時(shí)的體質(zhì)量-腫瘤質(zhì)量-分組給藥時(shí)的體質(zhì)量。

2.4.2 計(jì)算抑瘤率、q值、腫瘤指數(shù)、器官指數(shù)剝離瘤體組織，摘取肝、脾、腎、胸腺后分別稱(chēng)質(zhì)量。計(jì)算抑瘤率、腫瘤、肝臟、腎臟、脾臟、胸腺等的指數(shù)。抑瘤率 (%)=(模型對(duì)照組平均瘤質(zhì)量 -實(shí)驗(yàn)組平均瘤質(zhì)量)/模型對(duì)照組平均瘤質(zhì)量。q=EAB/［EA+(l-EA)EB］。式中EA為A藥(當(dāng)歸貝母苦參丸)抑瘤率，EB為B藥 (順鉑)抑瘤率，EAB為聯(lián)合用藥組兩藥合用的抑瘤率，q=0.85～1.15為兩藥作用相加，q＞1.25為兩藥作用增強(qiáng) (或協(xié)同)，q＜0.85為兩藥拮抗［4］。器官指數(shù)=器官質(zhì)量 (mg)/體質(zhì)量 (g)。

2.4.3 血常規(guī)檢測(cè) 在1.5 mL離心管中加入生理鹽水80 μL，滴加20 μL新鮮血液，以動(dòng)物血清分析儀檢測(cè)血常規(guī)。

2.4.4 HIF-1α和LDH檢測(cè) 按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清HIF-1α，按照血生化說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清LDH。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 樣本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以 (平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 荷瘤小鼠的一般狀況 接種成功后，瘤塊體積逐漸增大，外觀呈球形。初期能活動(dòng)，后來(lái)大多逐漸變硬。分組前荷瘤小鼠身形較勻稱(chēng) (瘤體隆起處除外)，動(dòng)作敏捷，反應(yīng)靈活，皮毛光滑，進(jìn)食進(jìn)水較正常;分組7 d，隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，順鉑組小鼠最先出現(xiàn)精神萎靡，飲食活動(dòng)減少，聚集一團(tuán)，皮毛成揪失去光澤，下腹部不潔凈，尿液變黃等現(xiàn)象。模型組負(fù)荷瘤體最大，活動(dòng)減少。給藥結(jié)束時(shí)各組小鼠一般狀況從正常到差排序:正常組、當(dāng)歸貝母苦參丸組、當(dāng)歸貝母苦參丸加順鉑組、模型組、順鉑組。

3.2 各組小鼠療前后體質(zhì)量和有效體質(zhì)量的變化見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠體質(zhì)量及有效體質(zhì)量變化比較 ()Tab.1 Changes in body weight and tumor-free body weight of each group()

表1 各組小鼠體質(zhì)量及有效體質(zhì)量變化比較 ()Tab.1 Changes in body weight and tumor-free body weight of each group()

注:與空白對(duì)照組比較，●P ＜0.05;與模型組比較，*P＜0.05;與順鉑組比較，ΔP＜0.05;與當(dāng)歸貝母苦參丸組比較，▲P ＜0.05

有效體質(zhì)量變化空白對(duì)照組組別 樣本數(shù) 首次給藥體質(zhì)量/g 處死時(shí)體質(zhì)量/g 體質(zhì)量變化/g 16 31.8±1.2 40.0±2.8 8.1±2.4 8.1±2.4模型對(duì)照組 16 29.4±0.9 37.5±1.2 8.1±1.2 2.5±1.7●順鉑組 16 29.8±1.3 22.5±1.2● -6.3±2.2●＊ -8.5±2.3●＊當(dāng)歸貝母苦參丸組 16 29.6±1.1 35.6±3.0Δ 6.1±2.4Δ 2.7±1.9Δ當(dāng)歸貝母苦參丸加順鉑組 16 29.4±1.3 26.9±1.8●＊▲ -2.5±1.3●＊Δ▲ -4.3±1.4●＊Δ▲

3.4 荷瘤小鼠器官指數(shù)比較 見(jiàn)表3。

3.5 荷瘤小鼠白細(xì)胞計(jì)數(shù)比較 見(jiàn)表4。

3.6 荷瘤小鼠血清HIF-1α水平和LDH活力 見(jiàn)表5。

表2 各組瘤體質(zhì)量 ()及抑瘤率的比較Tab.2 Tumor weight()and tumor inhibition rate of each group

表2 各組瘤體質(zhì)量 ()及抑瘤率的比較Tab.2 Tumor weight()and tumor inhibition rate of each group

注:與模型組比較，*P＜0.05;與順鉑組比較，ΔP＜0.05;與當(dāng)歸貝母苦參丸組比較，▲P ＜0.05

組別 樣本數(shù) 瘤體質(zhì)量/g 腫瘤指數(shù)/(mg·g-1) 抑瘤率/%16 5.5±1.3 148.6±35.9順鉑組 16 2.2±0.6* 93.0±24.4* 60.0當(dāng)歸貝母苦參丸組 16 3.4±1.0*Δ 95.1±19.4* 38.2當(dāng)歸貝母苦參丸加順鉑組 16 1.8±0.6*Δ 66.9±11.8*Δ，▲模型對(duì)照組67.2

表3 肝癌H22荷瘤小鼠肝臟指數(shù)、腎臟指數(shù)、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù) ()Tab.3 Indexes of liver，kidney，spleen，thymus of each group()

表3 肝癌H22荷瘤小鼠肝臟指數(shù)、腎臟指數(shù)、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù) ()Tab.3 Indexes of liver，kidney，spleen，thymus of each group()

注:與空白對(duì)照組比較，●P＜0.01;與模型對(duì)照組比較，*P＜0.01;與順鉑組比較，ΔP＜0.05;與當(dāng)歸貝母苦參丸組比較，▲P＜0.05

組別 樣本數(shù) 肝臟指數(shù)/(mg·g-1) 脾臟指數(shù)/(mg·g-1) 腎臟指數(shù)/(mg·g-1) 胸腺指數(shù)/(mg·g-1)16 39.8±8.0 3.5±0.5 5.0±1.2 3.0±0.9模型對(duì)照組 16 69.2±7.2● 10.3±3.4● 4.8±1.0 2.8±0.6順鉑組 16 53.9±8.9 2.3±0.7* 5.2±0.8 0.8±0.2●當(dāng)歸貝母苦參丸組 16 67.9±9.8● 11.5±4.4●Δ 5.3±0.8 2.5±0.6Δ當(dāng)歸貝母苦參丸加順鉑組 16 66.1±6.8● 3.5±0.5＊▲ 5.3±0.8 1.3±0.4●＊Δ▲空白對(duì)照組

表4 肝癌H22荷瘤小鼠白細(xì)胞計(jì)數(shù) (n=10，)Tab.4 Blood white cell count of each group(n=10，)

表4 肝癌H22荷瘤小鼠白細(xì)胞計(jì)數(shù) (n=10，)Tab.4 Blood white cell count of each group(n=10，)

注:與空白對(duì)照組比較，●P＜0.01;與模型對(duì)照組比較，*P＜0.01;與順鉑組比較，ΔP＜0.05;與當(dāng)歸貝母苦參丸組比較，▲P＜0.05

組別 白細(xì)胞/(109·L-1) 淋巴細(xì)胞/(109·L-1) 單核細(xì)胞/(109·L-1) 中性粒細(xì)胞/(109·L-1)3.74±1.52 2.32±0.93 0.13±0.13 1.30±0.27模型對(duì)照組 24.68±1.37● 15.57±1.40● 1.46±0.65● 7.67±1.6●順鉑組 6.16±1.65●＊ 4，97±1.60●＊ 0.06±0.04●＊ 1.11±0.80*當(dāng)歸貝母苦參丸組 11.74±3.9●＊Δ 5.20±0.87●＊ 0.49±0.58●＊Δ 6.05±3.30●Δ當(dāng)歸貝母苦參丸加順鉑組 7.06±1.11●＊▲ 4.20±1.09●＊ 0.32±0.17●＊Δ 2.54±1.64●＊Δ▲空白對(duì)照組

表5 各組小鼠血清HIF-1α水平、LDH活力比較 ()Tab.5 HIF-1α serum level and LDH activity of each group()

表5 各組小鼠血清HIF-1α水平、LDH活力比較 ()Tab.5 HIF-1α serum level and LDH activity of each group()

注:與空白對(duì)照組比較，●P＜0.05;與模型組比較，*P＜0.05;與順鉑組比較，ΔP＜0.05

組別 樣本數(shù) HIF-1α/(pg·mL-1) LDH/(μ·L-1)10 4.061±0.640 3999.35±295.55模型對(duì)照組 10 7.298±0.838● 3631.56±262.03順鉑組 10 3.443±1.159* 7456.70±506.58●＊當(dāng)歸貝母苦參丸組 10 4.842±0.470* 3837.41±1069.62Δ當(dāng)歸貝母苦參丸+順鉑組 10 3.769±0.877* 3791.45±1048.28空白對(duì)照組Δ

4 討論

本研究中小鼠移植瘤于注射瘤細(xì)胞懸液5～7日形成，符合中醫(yī)濕濁癌毒瘀久化熱，導(dǎo)致痰濁凝結(jié)，脾失健運(yùn)，不能升清化生精微，氣血生化乏源，氣血陰陽(yáng)失調(diào)，氣虛無(wú)力推動(dòng)血液運(yùn)行，氣滯痰凝、瘀血內(nèi)停，癌毒客居發(fā)展而生積聚的理論。治當(dāng)活血化瘀，化痰散結(jié)，清熱燥濕，攻癌殺毒，符合《內(nèi)經(jīng)》“堅(jiān)者消之，留者攻之，結(jié)者散之，客者除之”及“熱者寒之”的原則。當(dāng)歸貝母苦參丸始載于《金匱要略》，由當(dāng)歸、貝母、苦參等比例組成，具有養(yǎng)血和血、化痰散結(jié)、清熱燥濕的功效。順鉑攻殺癌毒力強(qiáng)，為君藥。順鉑性熱易耗傷陰津氣血，煉液生痰，臣以當(dāng)歸養(yǎng)血活血維持氣血通暢，佐以貝母清熱化痰保護(hù)肺臟布散津液、苦參清熱燥濕維持脾臟生化氣血，能收到較好抗癌療效。

精血同源，皆由水谷精氣化生或培育補(bǔ)充，二者可相互滋生和轉(zhuǎn)化。當(dāng)歸具有補(bǔ)血的功效，血旺使心肌等組織得到濡養(yǎng)，減少順鉑所致心肌組織損傷［5］。血能生精，使腎有所藏，腎氣則旺。腎氣健旺，則腎主骨生髓的功能得以恢復(fù)，為減輕順鉑化療引起的西醫(yī)上的腎毒性［6-7］、耳毒性［8-9］、性腺抑制［10］、骨髓抑制［11］、神經(jīng)毒性［12-13］提供了中醫(yī)學(xué)依據(jù)?？鄥⒖嗪湟愿蕼刂破湫晕?，使燥濕之功力專(zhuān)，有益于脾胃后天之本功能的發(fā)揮，減輕順鉑引起的惡心、厭食、嘔吐等消化系統(tǒng)癥狀，增加順鉑化療荷瘤小鼠的體質(zhì)量，改善荷瘤小鼠的生存狀態(tài)?，F(xiàn)代研究表明當(dāng)歸及其萃取物當(dāng)歸多醣能夠提高機(jī)體細(xì)胞和體液免疫［14］?？鄥A和苦參酮能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化和凋亡，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，調(diào)節(jié)免疫功能［15］。當(dāng)歸貝母苦參丸能夠拮抗順鉑化療引起的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)降低，有升高脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的作用，對(duì)荷瘤小鼠重要免疫器官具有一定的保護(hù)作用，可能與調(diào)節(jié)免疫的活性成分有關(guān)。

惡性腫瘤的治療療效與腫瘤細(xì)胞耐受缺氧的能力及化療損傷有關(guān)。HIF-1α是細(xì)胞對(duì)低氧的適應(yīng)性反應(yīng)，能夠促進(jìn)腫瘤組織代謝產(chǎn)物的清除及血管生成，其表達(dá)激活有助于腫瘤血管的生成和腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，預(yù)后差［16］。HIF-1α是腫瘤治療的靶點(diǎn)之一，各給藥組HIF-1α的水平下調(diào)，使腫瘤細(xì)胞耐受低氧的腫瘤微環(huán)境能力下降，影響腫瘤細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的清除，有利于抑制腫瘤的生長(zhǎng)［17］。Elberry等［18］的研究結(jié)果表明，對(duì)大鼠應(yīng)用順鉑72 h后可以檢測(cè)到明顯的腎臟組織病理?yè)p傷，血清LDH水平顯著升高，與本實(shí)驗(yàn)順鉑組血清LDH水平升高一致，而當(dāng)歸貝母苦參丸加順鉑組未檢測(cè)出LDH水平升高，或許與其減輕了順鉑損傷組織的程度有關(guān)。

研究具有抑瘤作用及對(duì)化療藥物具有增效減毒作用的中藥及其復(fù)方逐漸成為中醫(yī)藥研究的熱點(diǎn)。

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