楊威 董嘯 周建良 龔藝 徐建軍

【摘 要】 目的：探討PBEF在體外循環(huán)術后肺血管內皮通透性增加中的機制，為提出更好的體外循環(huán)期間肺保護措施提供依據。方法：建立動物模型并進行分組，A組僅行病毒轉染；B組僅行30min深低溫停循環(huán)；C組行病毒轉染后，再行30min深低溫停循環(huán)。應用Western blot檢測各組大鼠肺組織。結果：C組的PBEF、磷酸化P38MAPK、磷酸化ERK、磷酸化MLC、磷酸化VE-cadherin、磷酸化FAK表達明顯高于A、B組和對照組。結論：PBEF通過P38MAPK、ERK等途徑改變內皮細胞和平滑肌細胞中MLC的磷酸化狀態(tài)，VE-cadherin和FAK也參與了肺血管內皮通透性增加的過程。

【關鍵詞】 前B細胞克隆增強因子；體外循環(huán)；肺血管內皮；通透性

【中圖分類號】R654.1 【文獻標志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2014）19-0024-02

體外循環(huán)（cardiopulmonary bypass， CPB）技術是心臟外科手術的必備條件，但其帶來的術后肺損傷等并發(fā)癥一直威脅著行心臟手術的患者，重者發(fā)展為呼吸窘迫綜合癥，甚至死亡，嚴重威脅到患者的生存和預后。前B細胞克隆增強因子（pre-B-cell colony enhancing factor， PBEF）作為一種具有生長因子、細胞因子和煙酰胺磷酸核糖基轉移酶作用的分子，認為PBEF在急性肺損傷中起到非常重要的作用。并參與調控炎癥、氧化應激、細胞凋亡、內皮血管形成、心臟保護效應和免疫應答等多種作用。但具體機制仍不清楚，因此通過建立大鼠模型分析PBEF的作用機制，結果現(xiàn)報告如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選擇體重在25～30g之間的成熟雄性昆明種小鼠進行動物實驗（南昌大學心血管病研究所提供），按不同處理方法分4組，每組10只，所有小鼠均在室溫（24±2）℃，濕度（55±5）%環(huán)境中飼養(yǎng)，自由飲水、攝食，如在實驗過程中動物死亡，選取新小鼠進行補充。對照組動物在麻醉后建立體外循環(huán)，不行體外循環(huán)轉流；A組動物行慢病毒AD-PBEFshRNA轉染，在麻醉后建立體外循環(huán)，不行體外循環(huán)轉流；B組動物在建立體外循環(huán)后進行30min深低溫停循環(huán)；C組動物行同種病毒轉染后，再進行30min深低溫停循環(huán)。Western blot和免疫組化試劑盒購自美國Sigma公司。

1.2 方法 大鼠處死后取右肺前葉用于肺組織濕干重比的測定，右肺中后葉留待Western blot、ELISA和免疫組化檢測。按試劑盒說明分別進行Western blot和ELISA檢測，Western blot檢測磷酸化P38MAPK、磷酸化ERK、磷酸化MLC、磷酸化VE-cadherin、磷酸化FAK表達。免疫組化檢測PBEF，鏡檢以出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應[1]。

1.3 統(tǒng)計學分析 應用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件進行處理，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Western blot檢測結果 各組Western blot檢測結果見表1，C組磷酸化P38MAPK、磷酸化ERK、磷酸化MLC、磷酸化VE-cadherin、磷酸化FAK表達與A組、B組和對照組的差異顯著，具有統(tǒng)計學意義，P<0.05。見表1。

2.2 免疫組化檢測結果 A、B、C組在肺泡上皮細胞、肺血管內皮細胞胞核及氣管粘膜上皮細胞均有廣泛的棕黃色顆粒，PBEF高表達。C組PBEF的表達明顯高于A、B組和對照組，表達差異顯著，具有統(tǒng)計學意義，（P<0.05）；C組的PBEF表達與對照組的差異顯著，具有統(tǒng)計學意義，P<0.05。見表2。

3 討論

CPB技術隨著設備和技術的不斷進步，CPB帶來的并發(fā)癥已逐漸減少，但CPB術后肺缺血再灌注損傷仍是CPB術后死亡的主要原因之一[2-3]。雖然多年的研究從多方面解釋了CPB術后肺損傷的產生原因，因此通過針對產生肺損傷的分子機制的靶向研究，以明確靶向分子在CPB術后中的作用，為開發(fā)新的治療策略和新的防治藥物提供一定的研究經驗。

PBEF作為B細胞早期分化的一種生長因子，在炎癥細胞因子促進延長中性粒細胞生存期的過程中，會明顯增多細胞內PBEF的表達，在急性肺損傷動物模型中研究顯示PBEF的血清、肺組織中的表達明顯增加[4]。本研究就是通過RNAi技術抑制組織PBEF的表達，通過降低PBEF的表達以減少Ca2+的流動，改善內皮細胞屏障功能，抵消炎癥細胞因子對中性粒細胞的抗凋亡作用[5-8]。C-1535T作為PBEF基因啟動子區(qū)域，發(fā)生T變異會改變PBEF基因啟動子與轉錄因子的結合能力，降低PBEF的表達，減少炎癥反應時間，進而減少肺功能的損傷。本研究各組免疫組化檢測PBEF結果顯示，A、B、C組PBEF高表達，對照組PBEF低表達。PBEF過表達會延長炎癥反應時間，通過絲裂原活化蛋白激酶（mitogen一aetivatedproteinkinas， MAPK）途徑誘導炎癥因子的大量釋放，加重肺損傷。MAPK主要包括P38MAPK和ERK，磷酸化P38MAPK和ERK能夠通過多種胞內信號途徑改變會影響細胞收縮功能，降低PBEF蛋白表達進而改善凝血酶刺激造成的內皮細胞屏障功能障礙[9]。本研究顯示C組磷酸化P38MAPK、磷酸化ERK、磷酸化MLC、磷酸化VE-cadherin、磷酸化FAK表達明顯高于A組、B組和對照組，由此可知通過抑制PBEF的表達，可間接影響MAPK途徑多種酶表達表達。在血管內皮細胞內特異性表達，在內皮細胞間連接及血管內皮的通透性調節(jié)上具有重要作用。VE-cadherin通過調節(jié)上皮細胞激酶激活PI3K，而FAK能夠激活MAPK信號轉導分子，參與細胞信號轉導過程。從研究結果來看VE-cadherin和FAK可能參與了肺血管內皮通透性增加的過程[10]。

綜上所述，PBEF通過P38MAPK、ERK等途徑改變內皮細胞和平滑肌細胞中MLC的磷酸化狀態(tài)，VE-cadherin和FAK也參與了肺血管內皮通透性增加的過程，肺組織病理損害嚴重時VEGF、MMP2、MMP9呈現(xiàn)高表達。參考文獻

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