張廣芬，張明強(qiáng)，孫合亮，李強(qiáng)，于穎群，周志強(qiáng)

1.南京軍區(qū) 南京總醫(yī)院麻醉科，江蘇 南京 210002；2.解放軍第307醫(yī)院 麻醉科，北京 100071

近年來(lái)大量臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均表明，全麻藥氯胺酮具有快速有效抗抑郁作用，但其具體作用機(jī)制尚不明確[1-3]。研究表明，N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體阻斷后，微清蛋白（parvalbumin，PV）中間神經(jīng)元抑制功能下調(diào)，導(dǎo)致谷氨酸（Glu）信號(hào)系統(tǒng)去抑制[4-6]。鑒于Glu信號(hào)系統(tǒng)增強(qiáng)是氯胺酮抗抑郁的關(guān)鍵步驟[2,7]，我們推測(cè)氯胺酮可能通過(guò)阻斷PV中間神經(jīng)元上的NMDA受體，介導(dǎo)Glu信號(hào)系統(tǒng)去抑制，進(jìn)而產(chǎn)生抗抑郁作用。在本實(shí)驗(yàn)中，我們觀察了PV中間神經(jīng)元在氯胺酮抗抑郁中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性Wistar大鼠，體重200～250 g，由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證書編號(hào)為0016766。在室溫25℃、相對(duì)濕度為45%的動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由飲水，標(biāo)準(zhǔn)飲食。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥

采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠均分為4組（n=8）：生理鹽水組（S組）、氯胺酮（福建古田制藥廠，批號(hào)：20110301）組（K組）、夾竹桃麻素（Sigma公司）預(yù)處理+生理鹽水組（AS組）、夾竹桃麻素預(yù)處理+氯胺酮組（AK組）。大鼠行強(qiáng)迫游泳15 min制備急性應(yīng)激抑郁模型。夾竹桃麻素預(yù)處理組將藥物溶于大鼠飲水中，每天5 mg/kg，共喂養(yǎng)1周，于第8 d制備模型。模型制備后24 h大鼠腹腔注射1 mL生理鹽水或氯胺酮（10 mg/kg）。

1.3 敞箱實(shí)驗(yàn)（open field test，OFT）

生理鹽水或氯胺酮給藥后0.5 h應(yīng)用OFT進(jìn)行大鼠自主活動(dòng)評(píng)分，由2名經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的實(shí)驗(yàn)人員根據(jù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行盲法測(cè)評(píng)，取平均分。實(shí)驗(yàn)在一個(gè)底面積75 cm×75 cm并均分為25個(gè)方格，高40 cm，沒(méi)有頂蓋的敞箱內(nèi)進(jìn)行。每只大鼠被放在敞箱的中央格，手動(dòng)記錄大鼠在5 min內(nèi)的各項(xiàng)得分：水平得分，為大鼠水平穿越的方格數(shù)，大鼠3或4只腳爪都進(jìn)入一格記為1分；垂直得分，2只前爪每離開(kāi)底面一次記為1分。實(shí)驗(yàn)環(huán)境安靜，清潔敞箱后進(jìn)行下一只大鼠的測(cè)試。

1.4 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)（forced swimming test，F(xiàn)ST）

采用大鼠FST建立急性應(yīng)激抑郁模型，即將大鼠置于高65 cm、直徑30 cm、盛有23～25℃自來(lái)水的玻璃缸中，水深40 cm，游泳15 min。OFT測(cè)試后即刻將大鼠置入玻璃缸中行FST 6 min，觀察并記錄后5 min大鼠的不動(dòng)時(shí)間。行為學(xué)測(cè)試由2名經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的實(shí)驗(yàn)人員根據(jù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行盲法測(cè)評(píng)，取平均值。清潔玻璃缸后進(jìn)行下1只大鼠的測(cè)試。

1.5 Western印跡檢測(cè)PV及谷氨酸脫羧酶67（GAD67）的表達(dá)

大鼠用戊巴比妥鈉60 mg/kg于腹腔注射麻醉后經(jīng)左心室快速灌注4℃的生理鹽水200 mL，剝離前額皮層組織勻漿離心，取上清分裝并保存在-80℃冰箱中待用。用Bradford法測(cè)定蛋白濃度，電泳分離，轉(zhuǎn)膜。用封阻液室溫封阻2 h，將NC膜放入自封袋中，加PV（兔抗大鼠，1∶200）、GAD67（小鼠抗大鼠，1∶100），密封，垂直平面上緩慢旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)，4℃孵育過(guò)夜，TBST漂洗，用HRP標(biāo)記的二抗（羊抗兔/小鼠，1∶2000）室溫孵育3 h，TBST漂洗，再用TBS洗5 min，用ECL試劑反應(yīng)，曝光顯影，圖像掃描后采用Image J分析軟件，以目的蛋白與內(nèi)參β-actin灰度值的比值反映蛋白表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

計(jì)量數(shù)據(jù)以x±SEM表示，采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni法。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 氯胺酮對(duì)大鼠OFT水平運(yùn)動(dòng)及垂直運(yùn)動(dòng)的影響

4組大鼠水平運(yùn)動(dòng)及垂直運(yùn)動(dòng)均無(wú)顯著差異（P＞0.05），結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2 氯胺酮對(duì)大鼠FST不動(dòng)時(shí)間的影響

與S組相比，K組大鼠FST不動(dòng)時(shí)間明顯減少（P＜0.05），AS組無(wú)顯著差異（P＞0.05）；與K組相比，AK組大鼠FST不動(dòng)時(shí)間明顯增加（P＜0.05）（圖2）。

2.3 氯胺酮對(duì)大鼠前額皮層PV及GAD67表達(dá)的影響

與S組相比，K組大鼠PV及GAD67的表達(dá)明顯減少（P＜0.05），AS組無(wú)顯著差異（P＞0.05）；與K組相比，AK組大鼠PV及GAD67的表達(dá)明顯增加（P＜0.05）（圖3）。

3 討論

PV中間神經(jīng)元為γ-氨基丁酸（GABA）能中間神經(jīng)元，在調(diào)節(jié)錐體細(xì)胞的活動(dòng)中起著重要作用。研究表明，PV中間神經(jīng)元的功能下調(diào)在氯胺酮致精神分裂樣表現(xiàn)中發(fā)揮重要作用[4-5]。然而，在氯胺酮抗抑郁中PV中間神經(jīng)元是否亦發(fā)揮作用尚不清楚。本研究觀察到氯胺酮10 mg/kg具有明確的抗抑郁效果，能顯著減少?gòu)?qiáng)迫游泳大鼠不動(dòng)時(shí)間，夾竹桃麻素預(yù)處理能阻斷氯胺酮的這種抗抑郁作用；氯胺酮給藥后0.5 h大鼠大腦前額皮層PV中間神經(jīng)元中PV及GAD67的表達(dá)顯著下降，夾竹桃麻素預(yù)處理后能阻斷氯胺酮所致PV及GAD67表達(dá)的下降。

圖1 氯胺酮對(duì)大鼠敞箱實(shí)驗(yàn)水平運(yùn)動(dòng)及垂直運(yùn)動(dòng)的影響

圖2 氯胺酮對(duì)大鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間的影響

圖3 氯胺酮對(duì)大鼠前額皮層PV及GAD67表達(dá)的影響

前額皮層在抑郁癥等情感障礙中發(fā)揮重要作用，是研究氯胺酮抗抑郁機(jī)制常涉及到的腦區(qū)，故本研究選取大鼠前額皮層作為檢測(cè)區(qū)域[2-3]。Li等[2-3]研究表明，氯胺酮快速有效的抗抑郁作用依賴于磷酸化雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）的快速上調(diào)，進(jìn)一步導(dǎo)致下游信號(hào)通路的激活，從而促使突觸蛋白及突觸數(shù)量的增加，然而氯胺酮導(dǎo)致mTOR信號(hào)通路增強(qiáng)的潛在機(jī)制仍不清楚。以往研究證實(shí)，Glu能-α-氨基羥甲基惡唑丙酸（AMPA）受體活化在氯胺酮導(dǎo)致的mTOR信號(hào)通路增強(qiáng)中發(fā)揮重要作用[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，氯胺酮能夠?qū)е麓笫笄邦~皮層PV中間神經(jīng)元抑制功能下降，這可能促使Glu信號(hào)系統(tǒng)去抑制，從而發(fā)揮抗抑郁作用。

還原型輔酶Ⅱ（NADPH）抑制劑夾竹桃麻素能減少超氧化物的產(chǎn)生，阻斷氯胺酮所致PV及GAD67的表達(dá)下降[4]。因此，我們選用夾竹桃麻素預(yù)處理，結(jié)果表明這種預(yù)處理能夠阻斷氯胺酮的抗抑郁作用及其所致PV及GAD67蛋白表達(dá)的下降，進(jìn)一步表明PV中間神經(jīng)元在氯胺酮抗抑郁中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，本研究結(jié)果提示，PV中間神經(jīng)元在氯胺酮抗抑郁過(guò)程中發(fā)揮重要作用，但其確切機(jī)制仍須進(jìn)一步研究。

[1]Zarate C A Jr,Brutsche N E,Ibrahim L,et al.Replication of ketamine's antidepressant efficacy in bipolar depression:A randomized controlled add-on trial[J].Biol Psychiatry,2012,71(11):939-946.

[2]Li N,Lee B,Liu R J,et al.mTOR-dependent synapse forma?tion underlies the rapid antidepressant effects of NMDA antag?onists[J].Science,2010,329(5994):959-964.

[3]Li N,Liu R J,Dwyer J M,et al.Glutamate N-methyl-D-as?partate receptor antagonists rapidly reverse behavioral and syn?aptic deficits caused by chronic stress exposure[J].Biol Psy?chiatry,2011,69(8):754-761.

[4]Behrens M M,Ali S S,Dao D N,et al.Ketamine-induced loss of phenotype of fast-spiking interneurons is mediated by NADPH-oxidase[J].Science,2007,318(5856):1645-1647.

[5]Sorce S,Schiavone S,Tucci P,et al.The NADPH oxidase NOX2 controls glutamate release:a novel mechanism involved in psychosis-like ketamine responses[J].J Neurosci,2010,30(34):11317-11325.

[6]Moghaddam B,Adams B,Verma A,et al.Activation of gluta?matergic neurotransmission by ketamine:a novel step in the pathway from NMDA receptor blockade to dopaminergic and cognitive disruptions associated with the prefrontal cortex[J].J Neurosci,1997,17(8):2921-2927.

[7]Duman R S,Li N,Liu R J,et al.Signaling pathways underly?ing the rapid antidepressant actions of ketamine[J].Neurophar?macology,2012,62(1):35-41.

[8]Maeng S,Zarate C A Jr,Du J,et al.Cellular mechanisms un?derlying the antidepressant effects of ketamine:Role of α-ami?no-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid receptors[J].Bio Psychiatry,2008,63(4):349-352.