熊小敏 ，李薇

1.廣州軍區(qū) 廣州總醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 廣州 510010；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510405

近年研究表明，外周血單核細(xì)胞HLA-DR/CD14表達(dá)與臨床疾病的感染及嚴(yán)重程度密切相關(guān)，其表達(dá)水平反映患者機(jī)體的免疫狀態(tài)，可作為判斷急重癥疾病嚴(yán)重程度和預(yù)后的免疫指標(biāo)[1-6]。我們將該指標(biāo)應(yīng)用于臨床膿毒血癥患者，并同步進(jìn)行降鈣素原（procalcitonin，PCT）、C-反應(yīng)蛋白（C reactive pro?tein，CRP）、白細(xì)胞（white blood cells，WBC）計(jì)數(shù)等指標(biāo)檢測(cè)，比較膿毒血癥患者與正常對(duì)照組外周血單核細(xì)胞表面HLA-DR/CD14的表達(dá)水平，并對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)間的相關(guān)性進(jìn)行了分析。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象與分組

選擇2012-01～2013-07收入我院的ICU膿毒癥患者47例，所選病例符合修訂后的2010膿毒癥、嚴(yán)重膿毒癥、膿毒癥休克診斷標(biāo)準(zhǔn)[7-8]，根據(jù)感染病灶或細(xì)菌學(xué)檢查結(jié)果判斷是否存在感染，疾病嚴(yán)重程度依據(jù)APACHEⅡ[9]評(píng)分綜合評(píng)估。根據(jù)HLA-DR/CD14的閾值結(jié)果[1-3]，將＜30%的患者視為重度感染并設(shè)為觀察1組，共25例，其中男14例、女11例，平均年齡為63.88（29～93）歲；介于30%～49%之間的患者視為中度感染并設(shè)為觀察2組，共22例，其中男16例、女6例，平均年齡59.91（25～96）歲。同期選擇非感染引起炎癥而住院的患者（包括強(qiáng)直性脊柱炎患者、血管炎患者、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者等）設(shè)為觀察3組，共10例，其中男6例、女4例，平均年齡55.9（17～93）歲。同期選擇因其他疾病而住院的患者（包括高血壓患者、2型糖尿病患者、冠心病患者、帕金森病患者等）設(shè)為觀察4組，共18例，其中男13例、女5例，平均年齡60.33（16～92）歲。3、4組均依據(jù)膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)[7-8]排除感染。正常對(duì)照組為同期健康體檢者（肝腎功能、血脂四項(xiàng)、腫瘤標(biāo)志物、心電圖、X線(xiàn)胸片檢查等物理檢測(cè)均正常），共21例，其中男13例、女8例，平均年齡41.95（21～77）歲。

1.2 材料

CD14-FITC、HLA-DR-PE、小鼠IgG1-FITC、紅細(xì)胞裂解液、FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀均購(gòu)自BD Biosciences公司；Minividas全自動(dòng)免疫熒光分析儀及配套試劑購(gòu)自生物梅里埃公司；特種蛋白分析儀及配套試劑購(gòu)自SIEMENS公司；XE2100血細(xì)胞分析儀及配套試劑購(gòu)自廣州宜德醫(yī)療器械有限公司。

1.3 標(biāo)本采集

所有住院患者于治療前采集EDTA-K3靜脈抗凝血，用于檢測(cè)HLA-DR/CD14及WBC；同步采集靜脈血3 mL于干燥管中，待凝固后離心，血清用于PCT、CRP檢測(cè)。

1.4 標(biāo)本檢測(cè)

1.4.1 HLA-DR/CD14檢測(cè) 取抗凝全血各100 μL，分別加入測(cè)定、同型對(duì)照2管中，測(cè)定管加入20 μL HLA-DR-FITC、20 μL CD14-PE，同型對(duì)照管中加入20 μL小鼠IgG1-FITC、20 μL CD14-PE，混合后室溫避光反應(yīng)15 min；每管加入紅細(xì)胞裂解液2 mL作用10 min，1000 r/min離心5 min，棄上清；每管加入2 mL PBS，1000 r/min離心5 min，棄上清；加入1 mL鞘液混勻后上機(jī)分析。

1.4.2 PCT檢測(cè) 采用Minividas全自動(dòng)免疫熒光分析儀及配套試劑，結(jié)合一步免疫測(cè)定夾心法和最終熒光檢測(cè)法（ELFA）進(jìn)行測(cè)定

1.4.3 CRP檢測(cè) 采用特種蛋白分析儀及配套試劑，散射比濁法檢測(cè)。

1.4.4 WBC檢測(cè) 采用XE2100血細(xì)胞分析儀及配套試劑，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

1.5 結(jié)果分析

以CaliBRITE標(biāo)準(zhǔn)微球調(diào)節(jié)流式細(xì)胞儀PMT電壓、熒光補(bǔ)償、靈敏度，收集10 000細(xì)胞/管，以同型對(duì)照管CD14-PE/SSC散點(diǎn)圖中CD14細(xì)胞群設(shè)門(mén)，小鼠IgG1-FITC/CD14-PE散點(diǎn)圖確定陰性細(xì)胞區(qū)域，分析測(cè)定管HLA-DR FITC/CD14 PE散點(diǎn)圖中右上象限HLA-DR/CD14陽(yáng)性細(xì)胞百分率，結(jié)果以百分率表示。

PCT、CRP、WBC采用定量檢測(cè)，記錄具體數(shù)值。PCT正常參考范圍為＜0.05 ng/mL，CRP正常參考范圍為＜6.0 mg/L，WBC正常參考范圍為3.5×109～9.5×109/L。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用x±s表示。各組間指標(biāo)比較采用計(jì)量資料多組數(shù)據(jù)方差分析，組內(nèi)各指標(biāo)間相關(guān)關(guān)系采用雙變量相關(guān)分析；膿毒癥患者2組間存活率采用獨(dú)立樣本2×2列聯(lián)表資料的χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組數(shù)據(jù)均值及組間比較

選擇單向方差分析（One-Way ANOVA）方法進(jìn)行多組比較。對(duì)各組HLA-DR/CD14、PCT、CRP、WBC數(shù)據(jù)分別進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，Levene檢驗(yàn)方差不齊，P值均＜0.05，因此選擇方差不齊的多重比較方法Dunnett's T3，結(jié)果見(jiàn)表1。與正常對(duì)照組比較，1、2組各項(xiàng)指標(biāo)與正常組間存在顯著差異，P值均＜0.01，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；3組CRP與正常組CRP間存在顯著差異，P＜0.01，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與2組比較，1組除WBC外其他各項(xiàng)指標(biāo)間均存在顯著差異，P值均＜0.01，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3、4組與1、2組各項(xiàng)指標(biāo)間存在顯著差異，P值均＜0.01，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其他P值均＞0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 組內(nèi)各指標(biāo)的相關(guān)性比較

選擇積矩相關(guān)系數(shù)（Pearson相關(guān)系數(shù)r）進(jìn)行組內(nèi)相關(guān)性比較。觀察1組HLA-DR/CD14與PCT、CRP間存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與WBC間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，r值分別為-0.911、-0.975、0.231，前兩者P值均＜0.01，后者P＞0.05；觀察2組HLA-DR/CD14與PCT、CRP間存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與WBC間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，r值分別為-0.949，-0.915、-0.296，前兩者P值均＜0.01，后者P＞0.05。其他指標(biāo)比較P值均＞0.05，不存在相關(guān)關(guān)系。

表1 各組檢測(cè)項(xiàng)目結(jié)果分析（x±s）

2.3 膿毒癥患者觀察1、2組間存活率比較

設(shè)生存時(shí)間為28 d[5]，存活率定義為觀察組經(jīng)歷28 d后仍存活的可能性。膿毒癥患者2組間存活率比較采用獨(dú)立樣本2×2列聯(lián)表資料的χ2檢驗(yàn)（Pearson χ2檢驗(yàn)），結(jié)果見(jiàn)表2。經(jīng)計(jì)算可得，自由度ν=1，查表可知χ20.05,1=3.84，本例χ2=7.74＞χ20.05,1，可知P＜0.05，說(shuō)明2組的存活率具有顯著性差異。觀察1組的存活率為16.0%，觀察2組的存活率為54.5%，可以認(rèn)為觀察2組的存活率比觀察1組的存活率高。

2.4 膿毒癥患者觀察1、2組單核細(xì)胞表面HLADR/CD14表達(dá)的動(dòng)態(tài)觀察結(jié)果

對(duì)觀察1、2組中10例膿毒癥患者進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察分析，發(fā)現(xiàn)其中5例患者經(jīng)過(guò)積極治療后指標(biāo)仍未改善，并持續(xù)下降至16.96%±3.96%，直至死亡；另5例患者經(jīng)治療后指標(biāo)逐漸上升至63.90%±10.88%，恢復(fù)至正常水平，臨床癥狀同步改善直至治愈，與臨床報(bào)道[1]相符。

表2 膿毒癥患者2組間存活率比較

3 討論

白細(xì)胞分化抗原14（CD14）是一種特異性的單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物，屬于細(xì)胞表面糖蛋白家族，作為白細(xì)胞表面分化抗原最早被發(fā)現(xiàn)，后續(xù)研究證實(shí)CD14是脂多糖（LPS）的細(xì)胞受體，在機(jī)體的免疫反應(yīng)、表態(tài)性疾病、感染性疾病及多個(gè)系統(tǒng)的疾病發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。CD14在生理狀態(tài)下是單核/巨噬細(xì)胞的一種分化標(biāo)志物，其表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平上受髓樣細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)；病理情況下，根據(jù)某些部位單核/巨噬細(xì)胞上CD14的特異性表達(dá)異常及血清中sCD14[10]的濃度異常來(lái)對(duì)疾病作出診斷，判斷預(yù)后，指導(dǎo)臨床。近年來(lái)有研究報(bào)道，外周血單核細(xì)胞表面HLA-DR/CD14表達(dá)率與感染及疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，可作為判斷急重癥疾病嚴(yán)重程度和預(yù)后的免疫指標(biāo)[1,4-6]。

本研究表明，膿毒癥患者（包括重度感染組和中度感染組）HLA-DR/CD14表達(dá)水平明顯低于正常對(duì)照組，且與非感染炎癥組、其他疾病組也存在明顯差異，說(shuō)明該2組患者機(jī)體存在感染，免疫狀況異常，處于免疫抑制狀態(tài)，與臨床病情觀察相符，且該2組患者PCT、CRP、WBC值均明顯高于其他組，與其他3組比較，均存在顯著性差異。研究結(jié)果顯示，膿毒癥患者無(wú)論重度感染或中度感染，HLA-DR/CD14表達(dá)水平與PCT、CRP結(jié)果存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明HLA-DR/CD14表達(dá)水平下降時(shí)PCT、CRP升高；而與WBC結(jié)果間不存在顯著性關(guān)系，HLA-DR/CD14表達(dá)水平下降時(shí)，重度感染組WBC存在升高的現(xiàn)象，中度感染組WBC存在降低的現(xiàn)象，說(shuō)明HLADR/CD14表達(dá)水平下降時(shí)WBC有可能升高或降低。有研究報(bào)道，HLA-DR/CD14低于30%的患者經(jīng)治療后，若數(shù)值持續(xù)低下則存活率低，若數(shù)值升高至正常值或高于30%，免疫狀態(tài)得以改善，病情得以控制，甚至好轉(zhuǎn)出院；HLA-DR/CD14介于30%～49%的患者若經(jīng)治療后數(shù)值升高至正常值，病情得到控制，存活率較高，因此30%可設(shè)為臨床判斷患者病情嚴(yán)重程度及評(píng)估預(yù)后的閾值[1,3]。以28 d生存視為存活期觀察，發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者中HLA-DR/CD14低于30%的重度感染組患者存活率為16.0%，介于30%～49%的中度感染組患者存活率為54.5%，2組存活率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可以認(rèn)為中度感染組患者的存活率比重度感染組患者的存活率高。在對(duì)觀察1、2組中10例膿毒癥患者進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，有5例死亡患者HLA-DR/CD14表達(dá)率經(jīng)積極治療后仍持續(xù)下降并低于30%，而另5例存活患者HLADR/CD14表達(dá)率經(jīng)治療后逐漸上升，恢復(fù)至正常水平，說(shuō)明將HLA-DR/CD14閾值設(shè)為30%與臨床疾病重癥程度密切相關(guān)，與文獻(xiàn)報(bào)道相符合，提示膿毒癥患者具有免疫抑制特點(diǎn)，早期炎癥介質(zhì)增加，晚期則轉(zhuǎn)變?yōu)槊庖咭种茽顟B(tài)[11]。HLA-DR/CD14表達(dá)水平低下提示患者處于免疫抑制狀態(tài)，可作為感染性疾病免疫狀態(tài)評(píng)價(jià)指標(biāo)，用于臨床感染性疾病患者的免疫狀態(tài)評(píng)價(jià)、病程評(píng)估及診療評(píng)價(jià)[1-6]。

CRP、WBC作為實(shí)驗(yàn)室疾病輔助診斷的傳統(tǒng)檢測(cè)指標(biāo)已應(yīng)用于臨床，當(dāng)機(jī)體受到感染刺激后，CRP、WBC均有不同程度的變化，但特異性不強(qiáng)，各種原因引起的炎癥反應(yīng)也能使兩者升高，但臨床上仍進(jìn)行檢測(cè)證明這兩者仍有重要的作用，可作為預(yù)警信號(hào)。近年來(lái)PCT作為較新的實(shí)驗(yàn)室感染指標(biāo)，在膿毒血癥的診斷中具有重要意義，然而臨床上不可單一只用一個(gè)指標(biāo)作為臨床診斷指標(biāo)，聯(lián)合檢測(cè)可更好地指導(dǎo)臨床，無(wú)論是疾病診斷、病程監(jiān)控還是預(yù)后。聯(lián)合比較4項(xiàng)指標(biāo)的相關(guān)文獻(xiàn)較少，經(jīng)組內(nèi)各指標(biāo)相關(guān)性比較可知，聯(lián)合檢測(cè)這4項(xiàng)指標(biāo)有助于臨床感染性疾病評(píng)估、診療觀察，且動(dòng)態(tài)觀察HLA-DR/CD14表達(dá)率亦可監(jiān)測(cè)患者疾病的發(fā)展，并對(duì)預(yù)后作出正確評(píng)估[1,6，10,12-19]。

[1]李薇,謝聞悅,張衛(wèi)云,等.HLA-DR/CD14在外周血單核細(xì)胞中的表達(dá)及其臨床意義[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志,2011,36(1):61-63.

[2]蘇磊,周殿元,唐柚青,等.CD14+陽(yáng)性細(xì)胞人白細(xì)胞DR抗原在膿毒癥早期檢測(cè)中的臨床意義[J].中國(guó)危重病急救醫(yī)學(xué),2006,18(11):677-679.

[3]齊曼,夏成青,李文雄,等.外周血單核細(xì)胞膜CD14表達(dá)預(yù)測(cè)膿毒癥患者預(yù)后的研究[J].中華臨床醫(yī)師雜志（電子版）,2012,6(8):1993-1997.

[4]郭權(quán),畢偉.白細(xì)胞分化抗原14的研究進(jìn)展及意義[J].臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2011,10(3):215-217.

[5]膿毒癥免疫調(diào)理治療臨床研究協(xié)作組.烏司他丁、α1胸腺肽聯(lián)合治療嚴(yán)重膿毒癥——一種新的免疫調(diào)理治療方法的臨床研究[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2007,87(7):451-457.

[6]Prucha M,Zazula R,Müller M,et al.TREM-1 expression on monocytes is not a parameter specific for infectious etiology ofsystemicinflammatoryresponsesyndrome[J].PragueMed Rep,2011,112(3):205-215.

[7]李志軍,王東強(qiáng),田永超,等.2010德國(guó)膿毒癥指南解毒—關(guān)于膿毒癥的預(yù)防、診斷、治療及后續(xù)護(hù)理[J].中國(guó)危重病急救醫(yī)學(xué),2011,23(5):257-262.

[8]Dellinger R P,Levy M M,Rhodes A,et al.Surviving sepsis campaign:international guidelines for management of severe sepsis and septic shock:2012[J].Crit Care Med,2013,41(2):580-637.

[9]Knaus W A,Draper E A,Wagner D P,et al.APACHEⅡ:a severity ofdisease classification system[J].CritCare Med,1985:1(10):818-829.

[10]Liu B.Chen Y X,Yin Q,et al.Diagnostic value and prog?nostic evaluation of Presepsin for sepsis in an emergency de?partment[J].Crit Care,2013,17(5):R244.

[11]Oberholzer A,Oberholzer C,Moldawer L L.Sepsis syndromes:understandingtheroleofinnateand acquired immunity[J].Shock,2001,16(2):83-96.

[12]李曉,石玉玲,李林海,等.動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)血清降鈣素原對(duì)多發(fā)傷患者并發(fā)膿毒癥的診斷價(jià)值[J].生物技術(shù)通訊,2012,23(4):592-594.

[13]李政霖,祁恒旭,陳曉園.降鈣素原指導(dǎo)膿毒血癥患者抗感染治療的研究[J].中國(guó)醫(yī)藥指南,2012,10(9):19-20.

[14]陳肇杰,馮廣滿(mǎn),吳見(jiàn)歡,等.PCT和CRP檢測(cè)在炎癥診斷中的價(jià)值[J].貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2012,34(6):52-54.

[15]楊素華,洪旭濤,林偉峰.聯(lián)合檢測(cè)血清PCT、CRP水平變化對(duì)膿毒癥患者的診斷價(jià)值[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2012,22(12):2913-2915.

[16]楊清榮.C反應(yīng)蛋白、紅細(xì)胞和白細(xì)胞在內(nèi)科感染性疾病的診斷價(jià)值分析[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2011,8(7):38-39.

[17]景正全,淡珂,陳曉艷,等.C反應(yīng)蛋白聯(lián)合白細(xì)胞檢測(cè)在新生兒感染性肺炎中的臨床價(jià)值評(píng)價(jià)[J].中國(guó)婦幼保健,2012,27:1490-1491.

[18]李建華,姜曉云.血清CRP和血常規(guī)檢測(cè)在兒科中的應(yīng)用[J].吉林醫(yī)學(xué),2012,33(1):151-152.

[19]陳宏礎(chǔ),王鴻利.全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程[M].南京:東南大學(xué)出版社,2006:133.