張儼，馬晴雯,2

1.上海交通大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，上海市兒童醫(yī)院，上海交通大學(xué) 附屬兒童醫(yī)院，上海交通大學(xué) 醫(yī)學(xué)遺傳研究所，上海200040；2.衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)胚胎分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨上海市胚胎與生殖工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200040

多順反子載體在基因操作中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。目前常用的構(gòu)建多順反子載體的策略有：構(gòu)建多啟動子表達(dá)載體、構(gòu)建剪切載體、表達(dá)融合基因、基因之間以內(nèi)部核糖體插入位點(diǎn)（IRES）連接等。但這些構(gòu)建方法往往有載體容量有限、受細(xì)胞類型限制及不能表達(dá)多個(gè)蛋白等缺點(diǎn)。最近幾年發(fā)展出了自裂解多肽2A（self-cleaving 2A peptide）相關(guān)的構(gòu)建多順反子載體的新技術(shù)。自裂解多肽2A可應(yīng)用于多順反子載體的構(gòu)建，具有結(jié)構(gòu)短小、上下游基因表達(dá)平衡性好、可用于共表達(dá)多個(gè)蛋白等優(yōu)點(diǎn)，是一種構(gòu)建多順反子載體的有效工具[1]。

近幾年，利用2A多肽構(gòu)建多順反子表達(dá)載體的技術(shù)在干細(xì)胞研究中得到了大量應(yīng)用。2008年，Sommer等[2]聯(lián)合應(yīng)用2A和IRES首次構(gòu)建了一種多順反子慢病毒載體，該載體可同時(shí)表達(dá)Oct4、Klf4、Sox2和c-Myc等4種轉(zhuǎn)錄因子，并成功地將新生兒成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)成iPS細(xì)胞。Carey等[3]使用不同來源的2A序列（T2A、E2A和P2A）作為連接元件，構(gòu)建了含有Oct4、Klf4、Sox2和c-Myc轉(zhuǎn)錄因子的多順反子載體，并且分別在胚胎和成體細(xì)胞水平成功地誘導(dǎo)了小鼠和人體細(xì)胞的重編程。最近，有研究者分別使用IRES、F2A序列連接O（6）-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因和多藥耐藥性基因，通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染使這2個(gè)基因在造血干細(xì)胞系中過表達(dá)；與IRES的連接相比，F(xiàn)2A的連接對細(xì)胞起到了更好的保護(hù)效果[4]。我們采用來自一點(diǎn)褐翅蛾病毒（TaV）的T2A構(gòu)建共表達(dá)載體pCMV-GFP-T2A-Neo，轉(zhuǎn)染牛耳皮膚成纖維細(xì)胞，分析GFP和Neo基因在分子和細(xì)胞水平的表達(dá)情況，為在轉(zhuǎn)基因牛制備中利用2A進(jìn)行多基因轉(zhuǎn)移操作提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3為本所保存；原代牛耳皮膚成纖維細(xì)胞由本所大動物實(shí)驗(yàn)基地提供；大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技（北京）有限公司；質(zhì)粒pEGFP-N1和pcDNA3.1（+）分別購自Clontech和Invitrogen公司。

DMEM/F12培養(yǎng)液、血清、PBS和TRIzol試劑購自Life Technologies公司；胰蛋白酶購自Becton Dickinson公司；G418購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑購自Roche公司；限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶和Phusion超保真DNA聚合酶購自NEB公司；Taq酶、SYBR熒光定量PCR試劑和PrimeScript反轉(zhuǎn)錄酶購自TaKaRa公司；PCR純化試劑盒和膠回收試劑盒購自Qiagen公司；引物及T2A合成由Life Technologies公司完成。

1.2 載體pCMV-GFP-T2A-Neo的構(gòu)建

以NarⅠ和BamHⅠ雙酶切pcDNA3.1（+），去除SV40啟動子。因切除SV40啟動子時(shí)，Neo基因的部分片段也被切除，因此，以pcDNA3.1（+）為模板擴(kuò)增含有被切除的Neo基因片段（引物序列見表1），并與上述經(jīng)NarⅠ和BamHⅠ酶切的pcDNA3.1（+）載體相連，得到pcDNA3.1-CMV-Neo。將合成的T2A及其互補(bǔ)單鏈T2Arc（分別含有限制性內(nèi)切酶NheⅠ和BamHⅠ粘性末端，序列見表1）干粉配制為100 μmol/L的溶液后等摩爾混合，于100℃沸水中待其自然冷卻，即得到兩側(cè)分別為NheⅠ和BamHⅠ粘性末端的T2A雙鏈，將其連入pcDNA3.1-CMV-Neo相應(yīng)的酶切位點(diǎn)處，得到pcDNA3.1-CMV-T2A-Neo。以pEGFP-N1為模板，PCR擴(kuò)增含有NheⅠ和AvrⅡ酶切位點(diǎn)的GFP基因，接入pcDNA3.1-CMV-T2A-Neo中，得到目的載體pCMV-GFP-T2A-Neo。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

接種適量NIH3T3細(xì)胞或牛耳成纖維細(xì)胞至6孔板中，培養(yǎng)至85%～95%匯合度時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。需轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒用無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒制備。采用相同方法轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞和牛耳成纖維細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前進(jìn)行細(xì)胞換液，每孔細(xì)胞中加入2 mL新鮮培養(yǎng)基（DMEM/F12+10%血清）。6孔板中每孔細(xì)胞的轉(zhuǎn)染操作如下：取3.3 μg DNA加入不含血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中，吹打混勻，配成體積為157 μL的DNA混合液，隨后將DNA（μg）和轉(zhuǎn)染試劑（μL）按1∶3的比例加入9.9 μL FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑，輕輕吹打混勻，室溫靜置20 min，將轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入6孔板的細(xì)胞中，輕輕搖勻。另設(shè)轉(zhuǎn)染pEGFP-N1質(zhì)粒的陽性對照組和未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的空白對照組。轉(zhuǎn)染12 h后，換新鮮的含血清DMEM/F12培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 熒光激活細(xì)胞分選（FACS）分析

轉(zhuǎn)染48 h后，胰酶消化收集細(xì)胞，用PBS洗滌1～2次，取1×105以上的細(xì)胞用鞘液重懸，用流式細(xì)胞儀分析NIH3T3和牛耳皮膚成纖維細(xì)胞中pCMVGFP-T2A-Neo的轉(zhuǎn)染效率及EGFP的表達(dá)情況。

1.5 熒光定量PCR

轉(zhuǎn)染牛耳皮膚成纖維細(xì)胞48 h后，收集轉(zhuǎn)染組和空白對照組細(xì)胞，用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后用熒光定量PCR方法檢測GFP、T2A和Neo基因在mRNA水平的表達(dá)。引物及序列見表2。采用GraphPaD Prism 5軟件分析熒光定量PCR數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 共表達(dá)載體pCMV-GFP-T2A-Neo構(gòu)建

表1 構(gòu)建pCMV-GFP-T2A-Neo載體所用引物

構(gòu)建了共表達(dá)載體pCMV-GFP-T2A-Neo（5067 bp），經(jīng)NheⅠ和BglⅡ酶切鑒定（圖1），證明T2A序列已成功接入載體中。

2.2 熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)

熒光顯微鏡下觀察牛耳皮膚成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染pCMV-GFP-T2A-Neo后24 h綠色熒光蛋白的表達(dá)，以轉(zhuǎn)染pEGFP-N1的細(xì)胞作為對照，結(jié)果見圖2，pCMV-GFP-T2A-Neo可使GFP有效表達(dá)。

2.3 FACS檢測GFP在牛耳皮膚成纖維細(xì)胞和NIH 3T3細(xì)胞中的表達(dá)

采用FACS檢測2種細(xì)胞中GFP的表達(dá)情況，結(jié)果見圖3。pCMV-GFP-T2A-Neo可在原代培養(yǎng)的牛耳皮膚成纖維細(xì)胞和NIH3T3細(xì)胞中有效表達(dá)GFP，但表達(dá)水平低于pEGFP-N1，與熒光顯微鏡下觀察到的結(jié)果一致。

表2 熒光定量PCR引物

圖1 pCMV-GFP-T2A-Neo載體的酶切鑒定結(jié)果

2.4 定量PCR檢測目的基因的表達(dá)

定量PCR結(jié)果如圖4，在轉(zhuǎn)錄水平上，GFP、T2A和Neo表達(dá)水平相當(dāng)，處于同一個(gè)數(shù)量級。

3 討論

利用一個(gè)啟動子實(shí)現(xiàn)多基因共同表達(dá)，在轉(zhuǎn)基因克隆動物制備中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。相對于構(gòu)建多啟動子表達(dá)載體、構(gòu)建剪切載體、表達(dá)融合基因、基因之間以IRES連接等共表達(dá)載體構(gòu)建策略，2A序列在構(gòu)建多順反子載體中具有序列短小、易操作、上下游基因表達(dá)平衡性好等優(yōu)點(diǎn)，其在腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體、腺相關(guān)病毒載體和質(zhì)粒載體的構(gòu)建中都得到了廣泛應(yīng)用。我們利用T2A元件構(gòu)建的GFP和Neo共表達(dá)載體在轉(zhuǎn)入牛耳皮膚成纖維細(xì)胞后能夠正常翻譯，T2A及其相連的2個(gè)基因的mRNA表達(dá)量處于同一數(shù)量級。此外，T2A能夠在牛耳成纖維細(xì)胞中發(fā)揮自裂解功能，可將其作為一種平衡性較好的共表達(dá)策略應(yīng)用于牛耳皮膚成纖維細(xì)胞。但目前2A自裂解的機(jī)制尚不清楚，且可能存在未剪切前體，同時(shí)上游蛋白C端2A殘基的殘留可能影響蛋白的功能和定位[5-6]，如GFPT2A-Neo翻譯后T2A介導(dǎo)的斷裂會使上游的GFP帶上一段十幾個(gè)氨基酸殘基的多肽，這段多肽可能會影響GFP的高級結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響綠色熒光的強(qiáng)度，這有可能是造成牛耳成纖維細(xì)胞及NIH3T3細(xì)胞中GFP表達(dá)水平較pEGFP-N1載體上GFP單一表達(dá)框表達(dá)水平低的原因。相信隨著研究的深入，自裂解多肽2A將會作為構(gòu)建多順反子載體的強(qiáng)有力工具應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因牛的生產(chǎn)，若能同時(shí)與多種提高轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平的策略[7]相結(jié)合，有望提高表達(dá)轉(zhuǎn)基因大動物的制備效率。

圖2 牛耳皮膚成纖維細(xì)胞綠色熒光蛋白的表達(dá)（40×）

圖3 牛耳皮膚成纖維細(xì)胞和NIH3T3細(xì)胞中GFP的表達(dá)

圖4 定量PCR檢測牛耳皮膚成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染pCMV-GFP-T2A-Neo后細(xì)胞中GFP、T2A和Neo的表達(dá)

[1]張儼,李振海.多順反子載體構(gòu)建的策略及進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志,2012,9(5-6):429-433.

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[3]Carey B W,Markoulaki S,Hanna J,et al.Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector[J].Proc Natl Acad Sci USA,2009,106(1):157-162.

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