張耀方，馬百成，屠培培，李 寵，馬志華，姬艷麗，董 震，馬 超，郝軍鳳，李曉丹，王 宇，李明剛

（1.南開大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，分子生物學(xué)研究所，生物活性材料教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300071；2.天津農(nóng)學(xué)院，天津300384）

胰高血糖樣多肽1（glucagon－like peptide－1，GLP－1）是由腸道L細(xì)胞合成與分泌的30個氨基酸組成的多肽.研究表明，GLP－1具有顯著增強(qiáng)葡萄糖依賴性的胰島素分泌、減少食物攝取、減慢胃排空、抑制胰高血糖素分泌、刺激胰腺β細(xì)胞增殖、促進(jìn)胰島再生和抑制胰腺β細(xì)胞凋亡等作用［1－5］.目前，GLP－1及其相關(guān)新藥的研發(fā)已引起人們廣泛關(guān)注［6］.

水蛭素（hirudin）是從醫(yī)蛭（hirudomedieinalis）唾液腺中分離提純的一種酸性小分子蛋白質(zhì)，一般由65或66個氨基酸組成，分子量約為7 000.水蛭素可預(yù)防深靜脈血栓的形成［7－8］、急性冠脈綜合癥、心肌梗死［8－9］以及肝素誘導(dǎo)的血小板減少癥等［10］，可有效對抗腦出血損傷［11］并抑制腫瘤細(xì)胞的增殖［12］.由于水蛭素分子穩(wěn)定性極高，能耐受酸堿變化、高溫及各種蛋白酶的降解作用，因此可作為口服抗栓劑［7］.目前重組水蛭素在臨床上已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用.

人體內(nèi)存在的二肽酶Ⅳ（DPP－Ⅳ）可特異性識別GLP－1肽鏈N端第2位的Pro或Ala殘基，若在肽鏈的N端切除這兩個氨基酸，則GLP－1在體內(nèi)很快被降解為無生物活性的GLP－1（9－36）－NH2和GLP－1（9－37）［13－15］，其生物半衰期約為2min［16］，限制了其在臨床上的應(yīng)用.本文克隆了抗 DPP－Ⅳ和胰蛋白酶降解的GLP－1類似物，命名為重組口服長效促胰島素（recombinant oral long－acting GLP－1，rolGLP－1），并采用融合表達(dá)技術(shù)將改進(jìn)后的5個拷貝重組口服長效rolGLP－1與rHV基因串聯(lián)，得到了能防治糖尿病及其血栓并發(fā)癥的口服長效促胰島素水蛭素（5rolGLP－HV）.

1 材料與試劑

1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌DH5α和BL21（DE3）、pET22b（＋）及pMD18－T（含有rolGLP－1片段或rolGLP－HV 片段）均由南開大學(xué)生物技術(shù)與新藥實(shí)驗(yàn)室保存；rolGLP－1蛋白由南開大學(xué)生物技術(shù)與新藥實(shí)驗(yàn)室提供.

1.2 試劑和酶

限制性核酸內(nèi)切酶、T4DNA連接酶和5′磷酸化酶均購自日本TaKaRa公司；pfuDNA聚合酶購自北京鼎國生物工程有限公司；鏈脲佐菌素（STZ）購自美國Sigma公司；卡拉膠購自廣東肇慶海星食品工業(yè)有限公司；Ni－NTA購自瑞典Pharmacia公司；引物由上海生物工程有限公司合成，引物設(shè)計列于表1.

表1 引物設(shè)計Table 1 Prime design

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 pET22b（＋）－5rolGLP－HV 的構(gòu)建

5rolGLP－HV基因構(gòu)建過程如圖1所示.將rolGLP－1上游、rolGLP－1下游和rolGLP－rHV上游引物磷酸化，分別命名為P－rolGLP－1上游，P－rolGLP－1下游和P－rolGLP－HV；以P－rolGLP－1上游和rolGLP－1下 游 為 引物，pMD18－T－rolGLP－1 為 模 板 擴(kuò) 增 P－rolGLP－1；以rolGLP－1 上 游 和P－rolGLP－1下游為引物，pMD18－T－rolGLP－1為模板擴(kuò)增rolGLP－1－P；T4連接酶將rolGLP－1－P和P－rolGLP－1連接，分別以5rolGLP－1上游和P－rolGLP－1下游為引物，以連接液為模板擴(kuò)增2rolGLP－1－P；以P－rolGLP－1上游和XbaⅠ－rHV下游為引物，以pMD18－T－rolGLP－HV 為模板擴(kuò)增P－rolGLP－HV；T4 連 接 酶 將 2rolGLP－1－P 和 P－rolGLP－HV 連 接， 以 P－rolGLP－1 上 游 和XbaⅠ－rHV下游為引物，連接液為模板擴(kuò)增 P－3rolGLP－HV；T4連接酶將2rolGLP－1－P 和P－3rolGLP－HV 連接， 以 5rolGLP－1 上 游 和XbaⅠ－rHV下游為引物，擴(kuò)增5rolGLP－HV；分別以5rolGLP－HV－His上游和5rolGLP－HV－His下游為引物，以5rolGLP－HV 為模板擴(kuò)增5rolGLPHV－6 His.

將5rolGLP－HV－His基因片段和pET22b（＋）載體分別以KpnⅠ和HindⅢ酶切后T4連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，對鑒定為陽性的質(zhì)粒測序.陽性質(zhì)粒命名為pET22b（＋）－5rolGLP－HV.

圖1 pET－22b（＋）－5rolGLP－HV 的構(gòu)建過程Fig.1 Schematic illustration of pET－22b（＋）－5rolGLP－HVconstruction

2.2 5rolGLP－HV的表達(dá)和純化

2.2.1 5rolGLP－HV的表達(dá) 將測序正確的重組質(zhì)粒pET22b（＋）－5rolGLP－HV 轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21（DE3），挑取單菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基（含100mg／L氨芐青霉素）中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜.再將菌液以1∶100接種于新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至A600≈0.8，加入異丙基硫代－β－D 半乳糖苷（IPTG）至其終濃度為0.6mmol／L，37℃振蕩培養(yǎng)4h.4℃離心后收集菌體.誘導(dǎo)前的菌體為對照，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）分析.

2.2.2 5rolGLP－HV的Western blot鑒定 先將表達(dá)的5rolGLP－HV全菌體經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的SDS－PAGE電泳后，再將蛋白條帶轉(zhuǎn)印至醋酸纖維素膜上，在含50g／L脫脂奶粉的磷酸鹽緩沖液（PBS）中4℃封閉過夜，以小鼠抗人GLP－1為一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠lgG為二抗，進(jìn)行常規(guī)的Western blot檢測，并用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色.

2.2.3 5rolGLP－HV的純化 將IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液4℃離心收集菌體.Tris－HCl緩沖液重懸菌體，超聲破碎，離心，取上清液和沉淀進(jìn)行SDS－PAGE分析.

先以10倍柱體積的Tris－HCl洗柱，裂解上清液上樣，用10倍柱體積的Tris－HCl平衡柱體，含20mmol／L咪唑的Tris－HCl緩沖液（pH＝8.0）洗脫雜蛋白，再用含250mmol／L咪唑的Tris－HCl緩沖液（pH＝8.0）洗脫目的蛋白.最后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%SDS－PAGE電泳檢測分析.將目的蛋白透析除鹽，－80℃保存?zhèn)溆?

2.3 5rolGLP－HV對小鼠空腹血糖的影響

將雄性3周齡的C57／BL小鼠（體質(zhì)量（12±1）g）隨機(jī)分為兩組.正常組（n＝7）：喂食正常飼料；高脂高糖組：喂食高脂高糖飼料.喂食2個月后，將高脂高糖組小鼠腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）溶液100mg／kg，4周后，斷尾取血檢測小鼠空腹血糖，血糖值大于11mmol／L的即為造模成功的Ⅱ型糖尿病小鼠（n＝28）.將造模成功的糖尿病小鼠隨機(jī)分為4組（n＝7）進(jìn)行口服灌胃治療.陰性對照組：灌胃生理鹽水；陽性藥組：灌胃二甲雙胍300mg／kg；5rolGLP－HV實(shí)驗(yàn)組：灌胃16mg／kg的5rolGLPHV蛋白；rolGLP－1組：灌胃16mg／kg的rolGLP－1蛋白.連續(xù)灌胃3周，每隔7d檢測一次空腹血糖值.

2.4 5rolGLP－HV的抗血栓活性檢測

將昆明小鼠隨機(jī)分為2組.對照組（n＝5）：背部皮下注射50mg／kg質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的卡拉膠溶液，并灌胃質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的生理鹽水；實(shí)驗(yàn)組（n＝5）：背部皮下注射50mg／kg質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的卡拉膠溶液，并灌胃16mg／kg的5rolGLP－HV.觀察小鼠尾部血栓形成的時間及長度.

3 結(jié)果與分析

3.1 pET22b（＋）－5rolGLP－HV 的構(gòu)建

重組表達(dá)質(zhì)粒pET22b（＋）－5rolGLP－HV的PCR產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳分析，在500～750bp內(nèi)可見特異性DNA片段（圖2（A））；經(jīng)KpnⅠ和HindⅢ雙酶切可見約5 400bp的載體片段和約700bp的目的基因片段（圖2（B））.對重組質(zhì)粒pET22b（＋）－5rolGLP－HV進(jìn)行基因測序，結(jié)果表明，5rolGLP－HV－His堿基序列構(gòu)建正確.

圖2 瓊脂糖凝膠電泳分析5rolGLP－HV－His PCR擴(kuò)增（A）和pET22b（＋）－5rolGLP－HV 質(zhì)粒酶切鑒定（B）結(jié)果Fig.2 Agar electrophoresis result of 5rolGLP－HVfusion gene amplified by PCR （A）and recombinant plasmid pET22b（＋）－5rolGLP－HVdigested with digestion（B）

3.2 5rolGLP－HV的表達(dá)及Western blot鑒定

誘導(dǎo)12h的表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的SDS－PAGE分析，在分子量約24 000處可見特異的目的蛋白表達(dá)條帶，未經(jīng)誘導(dǎo)的重組菌無此條帶（圖3（A））.誘導(dǎo)后的菌體超聲破碎后沉淀和上清液經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的SDS－PAGE分析，考馬斯亮藍(lán)染色后，目的蛋白幾乎全部在上清液中，經(jīng)蛋白電泳分析軟件掃描顯示，在上清液中表達(dá)的目的蛋白約占總蛋白的12%（圖3（A））.Western blot鑒定表明，目的蛋白與小鼠抗人的GLP－1單克隆抗體有特異性反應(yīng)（圖3（B））.

圖3 E.coli BL21（DE3）／5rolGLP－HV表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的SDS－PAGE鑒定（A）和 Western blot鑒定（B）結(jié)果Fig.3 12%SDS－PAGE analysis results of the induction products of E.coli BL21（DE3）／5rolGLP－HV（A）and Western blot identification results of 5GLP－HV（B）

菌體破碎后，將上清液流經(jīng)Ni－NTA柱親和層析，在含250mmol／L咪唑的Tris－HCl緩沖液中洗下目的蛋白，收集蛋白并進(jìn)行SDS－PAGE分析，結(jié)果如圖4所示.由圖4可見，在第4泳道存在單一的目的條帶，表明5rolGLP－HV的純度較高.Bradford分析結(jié)果表明，蛋白的產(chǎn)率為25mg／L.

3.3 5rolGLP－HV對小鼠空腹血糖的影響

用STZ誘導(dǎo)的Ⅱ型糖尿病小鼠檢測5rolGLP－HV的降糖活性功能，結(jié)果如圖5所示.由圖5可見，正常組小鼠的血糖值變化較小，約為4.8mmol／L；陰性對照組小鼠血糖3周后由16.31mmol／L上升至20.21mmol／L，上升23.8%（p＜0.01）；陽性藥（二甲雙胍）組小鼠在灌胃第一周血糖下降較快，從16.03mmol／L下降至11.75mmol／L，下降26.7%（p＜0.01），灌胃第二周血糖略有上升，第三周血糖下降至10.82mmol／L，下降32.5%（p＜0.01）；rolGLP－1和5rolGLP－HV灌胃組小鼠在灌胃第一周血糖均下降較快，分別從17.77mmol／L和18.12mmol／L下降至15.07mmol／L和16.03mmol／L，分別下降15.2%（p＜0.01）和11.53%（p＜0.01），灌胃第二周血糖值均呈上升趨勢，但上升較慢，灌胃第三周血糖分別降至14.68mmol／L和14.3mmol／L，分別下降17.39%（p＜0.01）和21.08%（p＜0.01）；灌胃3周后，5rolGLP－HV 灌胃組比rolGLP－1灌胃組的降糖效果好（p＜0.05）.

圖4 純化前后促胰島素水蛭素（5rolGLP－HV）的SDS－PAGE電泳分析結(jié)果Fig.4 SDS－PAGE analysis result of purified 5rolGLP－HV

圖5 5rolGLP－HV對Ⅱ型糖尿病小鼠空腹血糖的影響Fig.5 Effect of 5rolGLP－HV on fasting blood glucose in typeⅡdiabetic mice

3.4 5rolGLP－HV抗血栓效果

本文采用一種無創(chuàng)性小鼠體內(nèi)血栓動物模型研究5rolGLP－HV的抗凝活性，通過觀察其尾部血栓出現(xiàn)的時間及程度（即相對長度）判斷5rolGLP－HV抗血栓效果，結(jié)果如圖6所示.由圖6可見：灌胃生理鹽水的對照組小鼠和5rolGLP－HV組小鼠在分別注射卡拉膠約24h和32h后尾部均出現(xiàn)明顯的血栓；對照組和5rolGLP－HV組小鼠尾部血栓形成的相對長度分別為（55.2±2.1）%和（29.6±2.7）%.

圖6 小鼠尾部血栓形成的測量結(jié)果Fig.6 Results of thromboplastic length of the mice’s tail blood

綜上所述，本文構(gòu)建了E.coli BL21（DE3）pET22b（＋）－5rolGLP－HV工程表達(dá)菌株.經(jīng)IPTG誘導(dǎo)菌體破碎后，目的蛋白在上清液中的表達(dá)量約占總蛋白的12%，其上清液經(jīng)Ni－NTA柱親和層析用含250mmol／L咪唑的Tris－HCl緩沖液洗脫即可獲得較高純度的5rolGLP－HV，產(chǎn)率為25mg／L.動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，5rolGLP－HV具有較好的降糖和抗血栓效果.

［1］Kreymann B，Williams G，Ghatei M A，et al.Glucagon－Like Peptide－1 7－36：A Physiological Incretin in Man［J］.Lancet，1987，330：1300－1304.

［2］Vahl T P，Paty B W，F(xiàn)uller B D，et al.Effects of GLP－1－（7－36）NH2，GLP－1－（7－37）and GLP－1－（9－36）NH2on Intravenous Glucose Tolerance and Glucose－Induced Insulin Secretion in Healthy Humans ［J］.Clin Endocrinol Metab，2003，88（4）：1772－1779.

［3］Turton M D，O’Shea D，Gunn I，et al.A Role for Glucagon－Like Peptide－1in the Central Regulation of Feeding［J］.Nature，1996，379：69－72.

［4］Deacon C F，Wamberg S，Bie P，et al.Preservation of Active Incretin Hormones by Inhibition of Dipeptidyl PeptidaseⅣ Suppresses Meal－Induced Incretin Secretion in Dogs［J］.Endocrinol，2002，172（2）：355－362.

［5］Pospisilik J A，Stafford S G，Demuth H U，et al.Long－Term Treatment with the Dipeptidyl PeptidaseⅣInhibitor P32／98Causes Sustained Improvements in Glucose Tolerance，Insulin Sensitivity，Hyperinsulinemia，and Beta－Cell Glucoseresponsi－Veness in VDF（fa／fa）Zucker Rats［J］.Diabetes，2002，51（4）：943－950.

［6］Segal J B，Dy S M，Millman E A，et al.Diffusion into Use of Exenatide for Glucose Control in Diabates Mellitus：A Retrospective Cohort Study of a New Therapy［J］.Clin Ther，2007，29（8）：1784－1794.

［7］Prisco D，F(xiàn)alciani M，Antonucci E，et al.Hirudins for Prophylaxis and Treatment of Venous Thromboembolism［J］.Semin Thromb Hemost，2001，27（5）：543－549.

［8］Meyer B J，Badimon J J，Chesebro J H，et al.Dissolution of Mural Thrombus by Specific Thrombin Inhibition with r－Hirudin：Comparison with Heparin and Aspirin［J］.Circulation，1998，97（7）：681－685.

［9］Chang J Y.Controlling the Speed of Hirudin Folding［J］.Biochemistry Journal，1994，300：643－650.

［10］Greinacher A， Lubenow N.Recombinant Hirudin in Clinical Peactice ［J］.Circulation， 2001，103（10）：1479－1484.

［11］XIA Ying，CHEN Xian－cheng，JI Yao－dong，et al.Research on the Effect of Hirudin Combineded with Recombinant Streptokinase Administrated in the Cavity of Intracerebral Hemorrhage ［J］.Chinese Journal of Neurosurgical Disease Research，2004，3（3）：245－248.（夏鷹，陳銜成，季耀東，等.水蛭素和重組鏈激酶聯(lián)合應(yīng)用于腦出血腫腔中的實(shí)驗(yàn)研究 ［J］.中華神經(jīng)外科疾病研究雜志，2004，3（3）：245－248.）

［12］PAN He，GANG Hong－lin，WANG Zhi－guo.Application Research of Hirudin and Recombinant Hirudin ［J］.Acta Chinese Medicine and Pharmacology，2006，34（2）：60－62.（潘賀，剛宏林，王志國.水蛭素及重組水蛭素的應(yīng)用研究概況 ［J］.中醫(yī)藥學(xué)報，2006，34（2）：60－62.）

［13］Knudsen L B，Pridal L.Glucagon－Like Peptide－1－（9－36）amide Is a Major Metabolite of Glucagon－Like Peptide－1－（7－36）amide after in vivo Administration to Dogs，and It Acts as an Antagonist on the Pancreatic Receptor［J］.European Journal of Pharmacology，1996，318（2／3）：429－435.

［14］Deacon C F，Plamboeck A，Moller S，et al.GLP－1－（9－36）amide Reduces Blood Glucose in Anesthetized Pigs by a Mechanism That Does Not Involve Insulin Secretion ［J］.American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism，2002，282（4）：E873－E879.

［15］Green B D，Mooney M H，Gault V A，et al.Lys9for Glu9Substitution in Glucagon－Like Peptide－1（7－36）amide Confers DipeptidylpeptidaseⅣResistance with Cellular and Metabolic Actions Similar to Those of Established Antagonists Glucagon－Like Peptide－1（9－36）amide and Exendin（9－39）［J］.Metabolism，2004，53（2）：252－259.

［16］Green B D，Liu H K，McCluskey J T，et al.Function of a Long－Term，GLP－1Treated，Insulin－Secreting Cell Line Is Improved by Preventing DPPⅣ－Mediated Degradation of GLP－1［J］.Diabetes Obesity Metabolism，2005，7（5）：563－569.