汪小華+劉剛+歐全宏+周湘萍+郝建明+劉劍虹+汪祿祥

摘要：用傅里葉變換紅外光譜法研究蠶豆病害葉片，結(jié)果顯示不同病害蠶豆葉片紅外光譜圖整體相似，它們的紅外光譜主要由蛋白質(zhì)、脂類和多糖的振動吸收帶組成，僅在1 800～1 300 cm-1范圍光譜的峰位、峰形及吸收強度有一些微小差異。對1 800～1 300 cm-1波數(shù)范圍的光譜圖進行二階導數(shù)處理，結(jié)果顯示蠶豆病害葉的二階導數(shù)譜差異明顯。對健康和病害蠶豆葉1 700～1 500 cm-1范圍光譜進行傅里葉自去卷積和曲線擬合處理后，得到蛋白質(zhì)酰胺Ⅱ帶（1 550 cm-1）、木質(zhì)素（1 605 cm-1）和酰胺I（1 650 cm-1）3個子峰，相應子峰的峰面積比例顯示差異，黃化卷葉病分別為24.01%、36.55%、39.44%，赤斑病分別為15.42%、42.98%、41.61%，輪紋病分別為32.39%、35.63%、31.98%，銹病分別為13.97%、46.40%、39.65%，健康葉片分別為38.86%、28.68%、32.47%，健康葉的酰胺Ⅱ帶子峰相對面積比病害葉的大，而其木質(zhì)素子峰相對面積比病害葉的小。對于子峰面積比A1 563/A1 605、A1 650/A1 605和A1 563/A1 654，4種病害葉的比值均比健康葉的相應數(shù)值小，4種病害葉之間也有差異。結(jié)果表明傅里葉變換紅外光譜（FTIR）結(jié)合曲線擬合可望對不同病害的樣品進行有效鑒別。

關(guān)鍵詞：傅里葉變換紅外光譜；蠶豆病害；二階導數(shù)光譜；曲線擬合

中圖分類號：O657.33；S435.23 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）17-4182-04

Curve-fitting Based FTIR of Diseased Leaves in Broad Bean

WANG Xiao-hua1a， LIU Gang1a， OU Quan-hong1a， ZHOU Xiang-ping1a， HAO Jian-ming1a，

Lu Jian-hong1b， WANG Lu-xiang2

（1a. School of Physics and Electronic Information；1b. Key Laboratory of Advanced Technique & Preparation for Renewable Energy Materials， Ministry of Education， Yunnan Normal University， Kunming 650092， China；

2. Institute of Quality Standards and Testing Technology， Yunnan Academy of Agricultural Sciences， Kunming 650223， China）

Abstract： Fourier transform infrared （FTIR） method was used to study diseased leaves in broad bean. Results showed that the infrared spectra of broad bean leaves were similar and mainly made up of the absorption bands of protein， lipid and polysaccharides. There were minor differences including the spectral peak position， peak shape and the absorption intensity in the range of 1 800～1 300 cm-1. There were obvious differences among their second derivative spectra in the range of 1 800～1 300 cm-1. After the procedure of the Fourier self-deconvolution and curve fitting of health bean leaf and broad bean diseased leaves in the range of 1 700～1 500 cm-1， three peaks were obtained at 1 560 cm-1 （amide Ⅱ）， 1 605 cm-1（lignin） and 1 650 cm-1 （protein amide I）. The ratios of relative areas of the bands of amide Ⅱ， lignin， and amide I were 38.86%， 28.68% and 32.47% in the spectrum of healthy leaf， respectively. It was distinguished from the diseased leaves （red spot leaf： 15.42%， 42.98% and 41.61%， ring spot leaf： 32.39%， 35.63% and 31.98%， rust leaf： 13.94%， 46.40% and 39.65%， yellowing leaf curl disease leaf： 24.01%， 36.55% and 39.44%）. For sub-band area ratios A1563/A1605， A1650/A1605 and A1563/A1654， those of four kinds of diseased leaves were smaller than that of healthy leaf. The results proved that FTIR combined with curve fitting might be a potentially useful tool for detecting different kinds of broad bean diseases.endprint

Key words： Fourier transform infrared （FTIR） spectroscopy； broad bean diseases； second derivative spectra； curve fitting

蠶豆又名胡豆、佛豆、川豆、羅漢豆，一年生或者兩年生草本植物，為糧食、蔬菜和飼料、綠肥兼用作物，起源于西南亞和北非。蠶豆含有8種必需氨基酸，碳水化合物含量47%～60%，營養(yǎng)價值豐富，含有豐富的鈣、蛋白質(zhì)、磷脂，不含有膽固醇，有益人體健康。嫩蠶豆具和胃、潤腸通便功效，蠶豆莖有止血、止瀉功能；蠶豆花具有降壓、止帶、止血之功效[1]。

蠶豆產(chǎn)量、質(zhì)量受病蟲害影響，病害以真菌性病害和病毒居多。葉部病害多為各種葉斑病，例如銹病、 輪紋病、赤斑病、褐斑病、黃化卷葉病（病毒）等，種類繁多，危害較大，主要為害葉片，有時也為害莖、葉柄和豆莢，如果病害大面積發(fā)生，可造成嚴重的經(jīng)濟損失[2]。目前植物病害防治以化學農(nóng)藥為主，不合理使用農(nóng)藥化肥、引起有害生物抗藥性和農(nóng)藥殘留等問題導致生態(tài)環(huán)境不斷被破壞，農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量下降。所以正確鑒別病害，并針對相應病害因地制宜，采取合理的防治措施，以期達到作物生態(tài)環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展[3]。

鑒別作物病害的常用方法有傳統(tǒng)生物學方法、顯微形貌觀察、分子生物學方法，這些方法都需要豐富的經(jīng)驗、熟練的操作技能，且耗時長。傅里葉變換紅外光譜（FTIR）是一種基于化合物中官能團和極性鍵振動的結(jié)構(gòu)分析技術(shù)，能反映分子官能團的振動模式，具有指紋特性，已成為探測生物組織中大分子結(jié)構(gòu)及相互作用的有力手段。紅外光譜無需對樣品進行分離提取處理，具有操作簡便、快速、低成本、無污染的特點，已經(jīng)大量用于植物、藥物等方面的研究[4-8]。李志永等[9]用FTIR對蠶豆銹病、莖基腐病、輪紋病、黃化卷葉病葉片與健康葉之間的差異進行過分析，并用主成分分析和聚類分析對樣品進行病害類型的分類取得了較好的效果。為此，以蠶豆輪紋病、蠶豆赤斑病、蠶豆黃化卷葉并和蠶豆銹病為研究對象，用傅里葉變換紅外光譜結(jié)合曲線擬合對蠶豆不同病害葉進行鑒別研究。

1 材料與方法

1.1 材料

蠶豆葉樣品于2011、2012年2～3月采自云南省曲靖市陸良縣，樣品自然干燥后保存待測。所有樣品取樣時避開葉脈，取病斑處的葉片。

用Perkin Elmer公司的Frontier傅里葉變換紅外光譜儀測譜，光譜范圍為4 000～400 cm-1，光譜分辨率為4 cm-1，掃描16次。

1.2 光譜采集及數(shù)據(jù)處理

取少量樣品放入瑪瑙研缽磨細，加入適量溴化鉀（KBr）研磨均勻后壓片，測紅外光譜，樣品光譜自動扣除溴化鉀背景。每種樣品采集5個紅外吸收光譜，取這5個光譜的平均光譜作為該樣品的紅外吸收光譜。光譜經(jīng)OMNIC 6.0紅外光譜軟件9點平滑、基線校正和歸一化預處理；選取1 800～1 300 cm-1范圍用軟件Origin 8.5獲取二階導數(shù)譜，用軟件Origin 8.5對原始光譜進行曲線擬合。

2 結(jié)果與分析

2.1 蠶豆葉片的紅外光譜特征分析

蠶豆葉片的平均紅外光譜如圖1所示。從圖1可以看出，蠶豆葉的FTIR譜主要峰有：3 410 cm-1附近有一強而寬的吸收峰，主要是O-H伸縮振動吸收[10]，2 920 cm-1和2 850 cm-1附近吸收峰歸屬于亞甲基（CH2）的反對稱和對稱伸縮振動[11]，2 954 cm-1附近吸收峰歸屬于甲基-（CH3）的反對稱伸縮振動，主要來自蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂類等細胞壁組織成分；l 737 cm-1附近的吸收峰歸屬為脂類羰基振動吸收；1 650 cm-1附近的吸收峰歸屬于蛋白質(zhì)酰胺I帶C=O的伸縮振動吸收、1 548 cm-1附近的吸收峰歸屬于酰胺Ⅱ帶N-H的彎曲振動和C-N的伸縮振動吸收；1 500～1 200 cm-1范圍主要是蛋白質(zhì)、脂肪、木質(zhì)素和多糖的混合振動吸收區(qū)[12]，1 456 cm-1和1 380 cm-1附近的峰歸屬為甲基的不對稱和對稱變角振動吸收；1 265 cm-1附近的吸收峰歸屬于蛋白質(zhì)酰胺Ⅲ帶振動吸收[13]；1 152 cm-1附近的峰歸屬為多糖類的C-OH伸縮振動，1 075 cm-1附近的峰歸屬為多糖類的C-O伸縮振動。這些光譜特征反映了蠶豆葉的主要成分是蛋白質(zhì)、多糖和脂類。

由圖1可以看出，不同病害的蠶豆葉的紅外變換光譜大致相似，在1 800～700 cm-1范圍存在小的差異。二階導數(shù)譜可以放大差異，提高光譜的分辨率。圖2是不同病害葉的二階導數(shù)譜，在1 800～1 300 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)，比較不同病害葉的光譜可以看出，蠶豆銹病葉片（d）的兩強峰位于1 575 cm-1和1 380 cm-1附近，蠶豆赤斑病葉片（b）的強峰位于1 575 cm-1附近，蠶豆健康葉片（e）的強峰位于1 470 cm-1附近，而其他兩者在1 470 cm-1附近有一中強度吸收峰，另外，蠶豆銹病葉片（d）的兩強峰1 575 cm-1比1 380 cm-1強。蠶豆健康葉片（e）在1 540 cm-1附近有一強峰，其他四者在1 530 cm-1處呈現(xiàn)很弱的峰。比較蠶豆輪紋病葉片（c）和蠶豆黃化病葉片（a）可知，在1 460 cm-1附近，蠶豆輪紋病葉片（c）的吸收峰強些，而在1 390 cm-1和1 440 cm-1附近蠶豆黃化病葉片（a）的吸收峰強些。由此可以看出，二階導數(shù)譜可以將不同病害的豆葉區(qū)分開來。

2.2 曲線擬合

紅外光譜吸收峰的強度往往由峰高、峰寬和峰強來決定，僅采用峰高來描述強度不夠準確，經(jīng)過傅里葉自去卷積和曲線擬合分峰處理后，使用峰面積來代表其強度更接近真實情況[14-16]。由圖2可以看出，健康葉片和病害葉片的差異主要在1 700～1 500 cm-1波數(shù)范圍。對1 700～1 500 cm-1波數(shù)范圍的不同蠶豆病害葉的紅外光譜進行曲線擬合，獲得3個子峰，如圖3所示。1 650 cm-1附近的吸收峰，主要是蛋白質(zhì)酰胺I帶吸收；1 550 cm-1附近的吸收峰，主要是蛋白質(zhì)酰胺Ⅱ帶吸收；1 605 cm-1附近是木質(zhì)素的吸收峰。通過吸收峰面積比A酰胺I/A木質(zhì)素、A酰胺Ⅱ/A木質(zhì)素和A酰胺Ⅱ/A酰胺I可以判斷葉片中蛋白質(zhì)相對含量的變化。endprint

通過傅里葉自去卷積和曲線擬合分峰處理后，黃化卷葉病得到3個子峰在1 559、1 610、1 654 cm-1，定義任意一個子峰面積除以3個子峰的面積和為該子峰的面積比例，黃化卷葉病相應子峰的峰面積比例分別為24.01%、36.55%、39.44%；赤斑病得到3個子峰在1 547、1 611、1 656 cm-1，相應子峰的峰面積比例分別為15.42%、42.98%、41.61%；輪紋病的3個子峰在1 565、1 611、1 654 cm-1，相應子峰的峰面積比例分別為32.39%、35.63%、31.98%；病葉3個子峰為1 546、1 606、1 654 cm-1，相應子峰的峰面積比例分別為13.94%、46.40%、39.65%；健康葉片3個子峰在1 563、1 605、1 654 cm-1，相應子峰的峰面積比例分別為38.86%、28.68%、32.47%。在1 605 cm-1處各圖譜，譜峰、譜型以及吸收峰強度均相似。通過吸收峰面積比A酰胺I/A木質(zhì)素、A酰胺Ⅱ/A木質(zhì)素和A酰胺Ⅱ/A酰胺I可以判斷不同病害葉中蛋白質(zhì)相對含量的變化。

表1是不同蠶豆病害豆葉中蛋白質(zhì)酰胺I帶、酰胺Ⅱ帶和木質(zhì)素的峰面積比。由表1可以看出，健康豆葉中A酰胺I/A木質(zhì)素大于1.1，其他都小于1.1，其中黃化病A酰胺I/A木質(zhì)素接近1.1；黃化病、赤斑病、輪紋病和銹病中A酰胺Ⅱ/A木質(zhì)素均小于1，而健康葉片的A酰胺Ⅱ/A木質(zhì)素大于1.1；在A酰胺Ⅱ/A酰胺I中最大為1.20（健康葉片），最小為0.35（銹?。?。結(jié)果表明，相對于健康葉片，不同病害感染的蠶豆葉中蛋白質(zhì)的含量相對降低了。結(jié)果提示由子峰面積比差異有可能區(qū)分蠶豆不同病害葉。

3 小結(jié)

對4種蠶豆病害葉和健康葉樣品進行了傅里葉變換紅外光譜研究，結(jié)果表明蠶豆葉的主要成分是蛋白質(zhì)、脂類和多糖。它們的紅外光譜圖在指紋特征區(qū)的峰形、峰強和峰位置整體相似。對1 700～1 500 cm-1范圍光譜，經(jīng)過傅里葉自去卷積和曲線擬合分峰處理后，3個子峰峰面積比（A1 650/A1 605、A1 563/A1 605和A1 563/A1 654）差異明顯。研究表明，傅里葉變換紅外光譜結(jié)合曲線擬合在鑒別不同蠶豆病害葉方面具有方便、快速、不破壞樣品等優(yōu)點。

參考文獻：

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[16] SAMYN P， NIEUWKERKE V D， SCHOUKENS G， et al. Quality and statistical classification of brazilian vegetable oils using mid-infrared and raman spectroscopy[J]. Applied Spectroscopy， 2012， 66（5）：552.endprint

通過傅里葉自去卷積和曲線擬合分峰處理后，黃化卷葉病得到3個子峰在1 559、1 610、1 654 cm-1，定義任意一個子峰面積除以3個子峰的面積和為該子峰的面積比例，黃化卷葉病相應子峰的峰面積比例分別為24.01%、36.55%、39.44%；赤斑病得到3個子峰在1 547、1 611、1 656 cm-1，相應子峰的峰面積比例分別為15.42%、42.98%、41.61%；輪紋病的3個子峰在1 565、1 611、1 654 cm-1，相應子峰的峰面積比例分別為32.39%、35.63%、31.98%；病葉3個子峰為1 546、1 606、1 654 cm-1，相應子峰的峰面積比例分別為13.94%、46.40%、39.65%；健康葉片3個子峰在1 563、1 605、1 654 cm-1，相應子峰的峰面積比例分別為38.86%、28.68%、32.47%。在1 605 cm-1處各圖譜，譜峰、譜型以及吸收峰強度均相似。通過吸收峰面積比A酰胺I/A木質(zhì)素、A酰胺Ⅱ/A木質(zhì)素和A酰胺Ⅱ/A酰胺I可以判斷不同病害葉中蛋白質(zhì)相對含量的變化。

表1是不同蠶豆病害豆葉中蛋白質(zhì)酰胺I帶、酰胺Ⅱ帶和木質(zhì)素的峰面積比。由表1可以看出，健康豆葉中A酰胺I/A木質(zhì)素大于1.1，其他都小于1.1，其中黃化病A酰胺I/A木質(zhì)素接近1.1；黃化病、赤斑病、輪紋病和銹病中A酰胺Ⅱ/A木質(zhì)素均小于1，而健康葉片的A酰胺Ⅱ/A木質(zhì)素大于1.1；在A酰胺Ⅱ/A酰胺I中最大為1.20（健康葉片），最小為0.35（銹?。?。結(jié)果表明，相對于健康葉片，不同病害感染的蠶豆葉中蛋白質(zhì)的含量相對降低了。結(jié)果提示由子峰面積比差異有可能區(qū)分蠶豆不同病害葉。

3 小結(jié)

對4種蠶豆病害葉和健康葉樣品進行了傅里葉變換紅外光譜研究，結(jié)果表明蠶豆葉的主要成分是蛋白質(zhì)、脂類和多糖。它們的紅外光譜圖在指紋特征區(qū)的峰形、峰強和峰位置整體相似。對1 700～1 500 cm-1范圍光譜，經(jīng)過傅里葉自去卷積和曲線擬合分峰處理后，3個子峰峰面積比（A1 650/A1 605、A1 563/A1 605和A1 563/A1 654）差異明顯。研究表明，傅里葉變換紅外光譜結(jié)合曲線擬合在鑒別不同蠶豆病害葉方面具有方便、快速、不破壞樣品等優(yōu)點。

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[15] KORKMAZ F， K？魻STER S， YILDIZ ？魻， et al. In situ opening/closing of OmpG from E. coli and the splitting of β-sheet signals in ATR–FTIR spectroscopy[J]. Spectrochimica Acta Part A， 2012， 91（6）： 395-401.

[16] SAMYN P， NIEUWKERKE V D， SCHOUKENS G， et al. Quality and statistical classification of brazilian vegetable oils using mid-infrared and raman spectroscopy[J]. Applied Spectroscopy， 2012， 66（5）：552.endprint

通過傅里葉自去卷積和曲線擬合分峰處理后，黃化卷葉病得到3個子峰在1 559、1 610、1 654 cm-1，定義任意一個子峰面積除以3個子峰的面積和為該子峰的面積比例，黃化卷葉病相應子峰的峰面積比例分別為24.01%、36.55%、39.44%；赤斑病得到3個子峰在1 547、1 611、1 656 cm-1，相應子峰的峰面積比例分別為15.42%、42.98%、41.61%；輪紋病的3個子峰在1 565、1 611、1 654 cm-1，相應子峰的峰面積比例分別為32.39%、35.63%、31.98%；病葉3個子峰為1 546、1 606、1 654 cm-1，相應子峰的峰面積比例分別為13.94%、46.40%、39.65%；健康葉片3個子峰在1 563、1 605、1 654 cm-1，相應子峰的峰面積比例分別為38.86%、28.68%、32.47%。在1 605 cm-1處各圖譜，譜峰、譜型以及吸收峰強度均相似。通過吸收峰面積比A酰胺I/A木質(zhì)素、A酰胺Ⅱ/A木質(zhì)素和A酰胺Ⅱ/A酰胺I可以判斷不同病害葉中蛋白質(zhì)相對含量的變化。

表1是不同蠶豆病害豆葉中蛋白質(zhì)酰胺I帶、酰胺Ⅱ帶和木質(zhì)素的峰面積比。由表1可以看出，健康豆葉中A酰胺I/A木質(zhì)素大于1.1，其他都小于1.1，其中黃化病A酰胺I/A木質(zhì)素接近1.1；黃化病、赤斑病、輪紋病和銹病中A酰胺Ⅱ/A木質(zhì)素均小于1，而健康葉片的A酰胺Ⅱ/A木質(zhì)素大于1.1；在A酰胺Ⅱ/A酰胺I中最大為1.20（健康葉片），最小為0.35（銹?。?。結(jié)果表明，相對于健康葉片，不同病害感染的蠶豆葉中蛋白質(zhì)的含量相對降低了。結(jié)果提示由子峰面積比差異有可能區(qū)分蠶豆不同病害葉。

3 小結(jié)

對4種蠶豆病害葉和健康葉樣品進行了傅里葉變換紅外光譜研究，結(jié)果表明蠶豆葉的主要成分是蛋白質(zhì)、脂類和多糖。它們的紅外光譜圖在指紋特征區(qū)的峰形、峰強和峰位置整體相似。對1 700～1 500 cm-1范圍光譜，經(jīng)過傅里葉自去卷積和曲線擬合分峰處理后，3個子峰峰面積比（A1 650/A1 605、A1 563/A1 605和A1 563/A1 654）差異明顯。研究表明，傅里葉變換紅外光譜結(jié)合曲線擬合在鑒別不同蠶豆病害葉方面具有方便、快速、不破壞樣品等優(yōu)點。

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