王芳+張慶慶+喬璐+葉建芬

摘要：通過響應面分析法優(yōu)化烏飯（Vaccinium bracteatum Thunb.）葉黃酮、多酚的提取工藝，并研究其體外抗氧化活性。結果表明，烏飯葉黃酮、多酚的最佳提取工藝條件為提取溶劑50%乙醇，料液比1∶41，提取時間50 min，提取溫度83 ℃，該條件下黃酮、多酚得率分別為33.4、23.5 mg/g。烏飯葉提取液清除DPPH·、·OH的IC50分別為4.8、11.3 μg/mL，其清除能力強于維生素C；同時，其還原能力強于維生素C，說明烏飯葉提取液具有較強的抗氧化活性。

關鍵詞：烏飯（Vaccinium bracteatum Thunb.）葉；黃酮；多酚；提??；抗氧化活性

中圖分類號：R282 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）17-4158-06

the Extraction of Flavonoids and Polyphenols from Vaccinium bracteatum Thunb. Leaves and Its Antioxidant Activity

WANG Fang， ZHANG Qing-qing， QIAO Lu， YE Jian-fen

（College of Chemistry and Life Science， Zhejiang Normal University， Jinhua 321004， Zhejiang， China）

Abstract：The extraction process of flavonoids and polyphenols from Vaccinium oracteatum Thunb. leaves （VBTL） was optimized with response surface method and the antioxidant activity of the product was studied. The results showed that the optimal extraction conditions of flavonoids and polyphenols were 50% ethanol， liquid/solid ratio of 1∶41， extraction time of 50 min and extraction temperature of 83 ℃. Under these conditions， the yields of flavonoids and polyphenols were 33.4 and 23.5 mg/g， respectively. Extracts from VBTL were found to have excellent DPPH· and ·OH scavenging activities with IC50 values of 4.8 and 11.3 μg/mL， respectively. It had stronger scavenging activity than VC had. It is indicated that the extracts have strong antioxidant capacity.

Key words： Vaccinium oracteatum Thunb. leaf； flavonoids； polyphenols； extraction； antioxidant activity

烏飯（Vaccinium bracteatum Thunb.）又名南燭、烏飯子等，杜鵑花科越橘屬，是一種藥食兼用植物。烏飯樹葉中含有豐富的蛋白質、多糖、維生素及黃酮、多酚類物質[1，2]，具有輕身養(yǎng)顏、黑發(fā)明目、促進視紅素再合成、改善血液微循環(huán)、抗病毒、抑菌性、抗氧化、抗癌防癌等多種生理活性[3-7]。烏飯樹在我國分布較廣，民間將其葉浸米制作烏米飯，將其果用于制作果醬和釀酒，但沒有形成工業(yè)化生產，烏飯樹綜合利用率低[1]。因此，開發(fā)和利用烏飯葉中黃酮類物質等活性成分，不僅能使資源得到有效利用，而且能帶來巨大的經濟和社會效益。本試驗采用響應面法對烏飯葉黃酮、多酚的提取工藝進行優(yōu)化，通過研究烏飯葉提取液清除DPPH·、羥自由基的能力和還原能力，來評價其抗氧化活性，以期為烏飯葉的進一步開發(fā)利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

烏飯葉：采購于金華農貿市場，室溫自然陰干，勻漿機粉碎后冷藏備用。

蘆丁、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）購自Sigma公司；抗壞血酸購自上海山浦化工有限公司，所用試劑均為分析純。

儀器：粉碎機（九陽股份有限公司）；UV-1000型紫外可見分光光度計（上海天美科學儀器有限公司）；BT224S型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；SC-5A型超級恒溫槽（寧波海曙億恒儀器有限公司）；離心機（Eppendorf公司）；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海一恒科技有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 黃酮、多酚得率的測定方法

1）黃酮得率測定。蘆丁標準曲線的繪制：分別吸取1.0 mg/mL的標準蘆丁溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL，加去離子水至3.0 mL，加5%亞硝酸鈉0.5 mL，混勻放置6 min，加10%硝酸鋁0.5 mL，混勻放置6 min，加5%NaOH 2.5 mL，混勻放置15 min，用去離子水定容至10 mL，以不加蘆丁標準液作空白對照，在波長490 nm處測定吸光度值。以吸光度為橫坐標，蘆丁濃度為縱坐標，繪制標準曲線[8，9]。endprint

黃酮得率計算：稱取1.0 g烏飯葉，浸提，上清液定容至100 mL，按制作標準曲線的方法測定其吸光度值，由線性回歸方程計算黃酮得率。

黃酮得率=C×10-3×[V/（V1×M）]×100%

其中，C為由標準曲線方程得出的黃酮濃度（mg/mL）；V為供試液體積（mL）；V1為測定所用樣品量（mL）；M為烏飯葉質量（g）。

2）多酚得率測定。稱取1.0 g烏飯葉，浸提，上清液定容至100 mL，取待測液2 mL于50 mL容量瓶中，依次加入8 mL去離子水和10 mL酒石酸鐵溶液；同時，做空白對照，分別取10 mL去離子水和10 mL酒石酸鐵溶液于容量瓶中，用磷酸緩沖液定容，靜置10 min，在波長540 nm處測定其吸光度，根據吸光度等于1.000時，相當于7.826 mg多酚計算得率[10]。

多酚得率=[（A×7.826）/103]×[T/（V×M）]×100%

其中，A為樣液的吸光度值；T為供試液總量（mL）；V為測定所用樣品量（mL）；M為烏飯葉質量（g）。

1.2.2 烏飯葉黃酮、多酚提取工藝 通過單因素試驗分別考察提取溶劑乙醇（0、30%、50%、70%、95%）、料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50）（g：mL，下同）、提取溫度（20、35、50、65、80 ℃）、提取時間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）4個因素對烏飯葉黃酮、多酚得率的影響。

在單因素的基礎上，根據Box-Behnken的中心組合試驗設計原理，選取料液比（X1）、提取溫度（X2）、提取時間（X3）為自變量，烏飯葉黃酮、多酚得率為響應值設計響應面試驗，因素和水平見表1。

1.2.3 抗氧化活性 稱取20.0 g烏飯葉干粉，按“1.2.2”所得最佳工藝進行提取，經旋轉蒸發(fā)、冷凍干燥后得到浸膏，置于4 ℃避光儲存?zhèn)溆谩?/p>

1）烏飯葉提取液對DPPH·的清除能力的測定。將浸膏配制為黃酮濃度分別為（1.0、5.0、10.0、15.0、20.0 μg/mL）的水溶液，各取0.5 mL，加入0.1 mmol/L DPPH無水乙醇溶液3.0 mL，混勻，室溫避光反應30 min，用紫外可見分光光度計在波長517 nm處測定其吸光度值Ai。同時，空白組（Aj）以等體積無水乙醇代替DPPH溶液，對照組（Ac）以等體積去離子水代替樣品溶液，以維生素C作陽性對照[11，12]。

清除率=[1-（Ai-Aj）/Ac]×100%

其中，Ac為對照組吸光度值；Ai為樣品吸光度值；Aj為空白組吸光度值。

2）烏飯葉提取液對羥自由基（·OH）清除能力的測定。在試管中依次加入2.5 mmol/L的FeSO4溶液2.0 mL，樣品溶液（將浸膏配制成黃酮濃度分別為5.0、25.0、50.0、75.0、100.0 μg/mL的水溶液）2.0 mL，2.5 mmol/L的H2O2溶液2.0 mL，混勻，靜置10 min，再加入2.5 mmol/L的水楊酸溶液2.0 mL，搖勻，靜置30 min后于波長510 nm處測其吸光度值Ai。同時，空白組（A0）以等體積去離子水代替樣品溶液，對照組（Aj）以等體積去離子水代替水楊酸，以維生素C作陽性對照[13]。

清除率=[1-（Ai-Aj）/A0]×100%

其中：A0為空白組吸光度值；Ai為樣品吸光度值；Aj為對照組吸光度值。

3）還原力的測定。將浸膏配制為不同黃酮濃度（30.0、45.0、60.0、75.0、90.0 μg/mL）的水溶液，各取2.5 mL加入2.5 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.6）和2.5 mL 1%的鐵氰化鉀溶液的混合液中，置于50 ℃水浴20 min。取出，在反應混合物中加入2.5 mL 10%的TCA（三氯乙酸），混合后以3 000 r/min離心10 min。然后，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL去離子水和0.5 mL 0.1%氯化鐵混勻，室溫靜置10 min后在波長700 nm處測定吸光度，以維生素C作陽性對照[14]。

2 結果與分析

2.1 蘆丁標準曲線

繪制蘆丁標準工作曲線（圖1），用最小二乘法作線性回歸，得出蘆丁濃度與吸光度值關系曲線的回歸方程為y=0.090 4x+0.000 1，R2=0.999 7。表明在一定范圍內，該方法線性關系良好，可以用來進行烏飯葉黃酮得率的測定。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 乙醇體積分數對烏飯葉黃酮、多酚得率的影響 由圖2可知，隨著乙醇體積分數的增加，烏飯葉黃酮和多酚得率也隨之增大，當乙醇體積分數為30%時，黃酮得率達到最大值1.1%；在乙醇體積分數為50%時，多酚得率達到最大值0.9%，這可能是當乙醇體積分數達到最佳時，烏飯葉中醇溶性的黃酮苷元成分和水溶性的糖苷成分的溶解度最大，當體積分數過大時，一些醇溶性雜質、脂溶性物質的溶出量增加，從而影響了黃酮、多酚的浸出[15]。故綜合考慮選取50%乙醇進行后續(xù)試驗。

2.2.2 料液比對烏飯葉黃酮、多酚得率的影響 由圖3可知，隨著料液比的升高，烏飯葉黃酮、多酚得率也不斷增加，但當料液比超過1∶40之后，黃酮得率無明顯變化，而多酚得率呈下降趨勢，這可能是當原料量一定時，隨著提取溶劑的增加，烏飯葉中黃酮、多酚溶出量隨之增大，但當提取溶劑達到一定程度，烏飯葉中有效成分已基本溶出，此時繼續(xù)增加提取溶劑，脂溶性物質隨之增加，不利于烏飯葉中有效成分的提取[16]。故選取料液比為1∶40進行后續(xù)提取試驗。

2.2.3 提取溫度對烏飯葉黃酮、多酚得率的影響 由圖4可知，烏飯葉黃酮得率隨著提取溫度的升高而增大，當溫度達到80 ℃時，黃酮得率達到2.8%；當溫度達到65 ℃時，多酚得率明顯增大，80 ℃時達到2.1%，這可能是隨著提取溫度不斷升高，分子運動加快，黃酮、多酚的溶解度不斷增大，且高溫易導致細胞膜破損，有利于有效成分從組織細胞轉移到提取溶劑中，增加了有效成分的溶出量[17]。同時， 由于乙醇的沸點為78 ℃，故選取提取溫度為80 ℃為宜。endprint

2.2.4 提取時間對烏飯葉黃酮、多酚得率的影響 圖5結果表明，隨著提取時間的增加，烏飯葉黃酮得率變化不明顯，而1.0 h后黃酮得率明顯下降；當提取時間為1.0 h時，多酚得率達到最大值1.8%，之后，多酚得率明顯下降。這可能是1.0 h時，有效物質已基本溶出，而長時間的高溫可能會破壞已溶出的有效成分[18]，導致黃酮、多酚得率下降。故選擇提取時間為1.0 h為宜。

2.3 響應面法試驗結果

根據表2的試驗結果，利用Design-Expert軟件對試驗數據進行回歸擬合后，得到X1、X2、X3與黃酮得率、多酚得率之間的二次多項回歸方程。黃酮得率=3.22+0.2 X1+0.32 X2-0.17 X3-0.11 X1X2+0.17 X1X3-0.15 X2X3-0.26 X12-0.25 X22-0.37 X32，多酚得率=2.28+0.21 X1+0.21 X2-0.16 X3-0.098 X1X2+0.088 X1X3-0.088 X2X3-0.31 X12-0.17 X22-0.30 X32。

對回歸模型進行方差分析，結果見表3、表4。由表3可以看出，回歸模型顯著，擬合程度和可信度較好，試驗誤差較小，可以用此模型對黃酮得率進行分析和預測。對模型回歸方程系數進行顯著性檢驗和方差分析（表3），結果表明料液比（X1）、二次項X12、X32對黃酮得率有顯著影響，提取溫度（X2）對其有極顯著影響。影響烏飯葉黃酮得率的3個因素按大小依次為提取溫度（X2）、料液比（X1）、提取時間（X3）。

由表4可以看出，回歸模型顯著，擬合程度和可信度較好，試驗誤差較小，可以用此模型對多酚得率進行分析和預測。對模型回歸方程系數進行顯著性檢驗和方差分析（表4），結果表明X1、X2、X12、X32對多酚得率有顯著影響。提取溫度（X2）和料液比（X1）對烏飯葉多酚得率的影響均大于提取時間（X3）對多酚得率的影響。

2.4 響應面分析

用Design-Expert軟件對表2數據進行回歸擬合后，得到不同提取條件對烏飯葉黃酮得率、多酚

得率影響的響應面（圖6-11）。圖6至圖11直觀地

反映各因素的改變對烏飯葉黃酮、多酚得率的影響，分析3組響應面曲線圖可知，料液比（X1）和提取溫度（X2）對烏飯葉黃酮、多酚得率有顯著影響，表現

為曲線陡峭；提取時間（X3）對烏飯葉黃酮、多酚得率影響較小，表現為曲線相對平緩。

2.5 烏飯葉黃酮、多酚提取工藝條件的優(yōu)化

通過Design-Expert軟件優(yōu)化，得到烏飯葉黃酮最佳提取條件為料液比1∶40.6，提取溫度83.5 ℃，提取時間0.8 h，此時黃酮最大得率理論值為34.0 mg/g；多酚最佳提取工藝條件為料液比1∶40.9，提取溫度83.2 ℃，提取時間0.8 h，此時多酚最大得率理論值為24.0 mg/g。考慮到實際操作的便利性，將最佳提取工藝修正為50%乙醇，料液比1∶41，提取溫度83 ℃，提取時間50 min。在此優(yōu)化工藝下進行驗證試驗，實際測得黃酮、多酚得率分別為33.4、23.5 mg/g，與理論值接近，表明該工藝可行，具有實用價值。

2.6 抗氧化試驗結果

2.6.1 清除DPPH·的能力 從圖12可知，一定濃度范圍內，隨著供試溶液濃度的增加，維生素C和烏飯葉提取液對DPPH·的清除率隨之增大。維生素C和烏飯葉提取液清除DPPH·的IC50分別為10.1、4.8 μg/mL，說明烏飯葉提取液具有較維生素C更強的清除DPPH·的能力。

2.6.2 清除·OH的能力 由圖13可知，一定濃度范圍內，烏飯葉提取液清除·OH的能力隨著濃度增大而增強，呈現劑量效應關系。維生素C和烏飯葉提取液清除·OH的IC50分別為93.6、11.3 μg/mL，說明烏飯葉提取液具有較強的清除·OH的能力，且強于維生素C。

2.6.3 還原能力 圖14結果表明，一定濃度范圍內，烏飯葉提取液和維生素C的吸光度值隨著其濃度的增加而增大。維生素C和烏飯葉提取液黃酮濃度為90.0 μg/mL時，其吸光度值分別為0.921、1.773，說明烏飯葉提取液具有較強的還原能力，且強于維生素C。

3 結論

采用響應面法優(yōu)化烏飯葉黃酮、多酚的提取工藝，得到最佳提取工藝為提取溶劑50%乙醇、料液比1∶41、提取時間50 min、提取溫度83 ℃，該條件下黃酮、多酚最大得率分別為33.4、23.5 mg/g。

烏飯葉提取液具有較強的抗氧化性，隨提取液中黃酮濃度的升高，清除DPPH·、·OH和還原能力增強。其清除DPPH·、·OH的IC50分別為4.8、11.3 μg/mL；而維生素C清除DPPH·、·OH的IC50分別為10.1、93.6 μg/mL；還原力測定中，維生素C和烏飯葉提取液黃酮濃度為90.0 μg/mL時，其吸光度值分別為0.921、1.773，說明烏飯葉提取液具有較維生素C更強的抗氧化活性。

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