向玉勇+朱園美+殷培峰

摘要：運用Wrights-Giemsas染色和光學(xué)顯微鏡對金銀花尺蠖（Heterolocha jinyinhuaphaga Chu.）幼蟲血細(xì)胞的形態(tài)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)金銀花尺蠖幼蟲血淋巴中有原血胞、漿血胞、粒血胞、珠血胞、類絳血胞和囊血胞6 種類型的血細(xì)胞。

關(guān)鍵詞：金銀花尺蠖（Heterolocha jinyinhuaphaga Chu.）；血細(xì)胞；形態(tài)觀察

中圖分類號：Q969.93 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）17-4052-04

Morphological Observation on Larva Hemocytes of Heterolocha jinyinhuaphaga Chu.

XIANG Yu-yong， ZHU Yuan-mei， YIN Pei-feng

（School of Biology and Food Engineering， Chuzhou University， Chuzhou 239012，Anhui，China）

Abstract： The larva hemocytes morphous of Heterolocha jinyinhuaphaga Chu. was observed with Wright's-Giemsa's stain method and light microscopy technology. The results showed that there were 6 types of hemocytes in larva hemolymph of Heterolocha jinyinhuaphaga Chu.including prohemocytes， plasmatocytes， granulocytes， spherulocytes， oenocytoids and cystocytes.

Key words： Heterolocha jinyinhuaphaga Chu.； hemocytes；morphous observation

昆蟲是動物界中最大的類群，在長期進(jìn)化的過程中形成了一套復(fù)雜的免疫系統(tǒng)，對入侵的病原體具有識別和清除能力，主要包括體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答[1，2]。血細(xì)胞是昆蟲細(xì)胞免疫的主要執(zhí)行者，在抵抗病原體入侵的免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮著重要作用。昆蟲種類不同，參與細(xì)胞免疫的血細(xì)胞種類不同[3]，血細(xì)胞的某些生理機能變化常常表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)和組成的變化。因此，研究昆蟲血細(xì)胞形態(tài)分類對深入揭示其細(xì)胞免疫功能具有重要推動作用。自1669年Swammerdam首次發(fā)現(xiàn)昆蟲的“白”血細(xì)胞以來[4，5]，人們對昆蟲血細(xì)胞的研究已有 340多年的歷史，涉及蚊（Culicidae）、蠅（Muscidae）、 蚋（Simuliidae）、蜚蠊（Blattaria）、蠶（Bombyx mori）、粘蟲[Mythimna separata（Walker）]等100多種昆蟲[6，7]。由于昆蟲種類繁多，其血細(xì)胞形態(tài)各異，甚至同一種昆蟲不同蟲態(tài)、蟲齡在不同生態(tài)、生理條件下的血細(xì)胞形態(tài)也存在顯著差異。昆蟲血細(xì)胞的分類比較復(fù)雜，存在的分歧很多[8]。因此，應(yīng)對更多種類的昆蟲血細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行研究，以豐富其形態(tài)分類。

金銀花尺蠖（Heterolocha jinyinhuaphaga Chu.）是近年來新發(fā)現(xiàn)的為害金銀花的食葉害蟲之一，該蟲為鱗翅目尺蛾科昆蟲，別名拱腰蟲，在安徽省1年發(fā)生3代[9]，常將葉片咬成缺刻或孔洞，危害嚴(yán)重的地塊金銀花葉片被全部吃光，僅剩葉脈和葉柄，常造成金銀花大面積減產(chǎn)，甚至成片死亡，給金銀花生產(chǎn)帶來嚴(yán)重?fù)p失。目前，國內(nèi)對金銀花尺蠖的研究主要集中在生物學(xué)特性及防治方面[9-13]，對其血細(xì)胞的形態(tài)學(xué)研究尚未見報道。本研究對金銀花尺蠖幼蟲血細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察，以期為金銀花尺蠖幼蟲血細(xì)胞分類和細(xì)胞免疫研究提供試驗依據(jù)， 同時也為金銀花尺蠖的防治提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

從滁州市郊三界鎮(zhèn)野生金銀花上采集金銀花尺蠖幼蟲，帶回實驗室于人工氣候箱（RXZ-288A型，寧波江南儀器制造廠）中用新鮮的金銀花葉片飼養(yǎng)多代，選取老熟幼蟲備用。人工氣候箱光周期（L∶D）為14 h∶10 h，溫度為（25±1） ℃，相對濕度為（70±7）%。

1.2 試劑

Wrights染料（Sigma公司）、Giemsa染料（德國AppliChem公司）、磷酸二氫鉀（廣東西隴化工股份有限公司）、磷酸氫二鈉（廣東西隴化工股份有限公司）、甘油（無錫市晶科化工有限公司）、甲醇（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 染液配制 Wrights染液：稱取Wrights染料粉末0.1 g放在研缽內(nèi)，加入60 mL甲醇充分研磨，使染料全部溶解，然后把溶解的染料倒入干凈的棕色玻璃瓶中，在室溫條件下密封保存，7 d后即可使用。

Giemsa染液：稱取Giemsa粉0.75 g放入研缽中， 加入50 mL甘油， 研磨后置于58 ℃水浴中攪拌加熱90 min，溶入50 mL甲醇中，搖勻后置于37 ℃恒溫箱內(nèi)保溫8～12 h，過濾后置于棕色瓶中密封保存，即為Giemsa原液，12 h后即可使用。臨用時，取1 mL Giemsa原液與10 mL PBS（pH 6.8）混合。

1.3.2 配制1/15 mol/L磷酸緩沖液（PBS）

pH 6.8：稱取磷酸氫二鈉0.47 g，磷酸二氫鉀0.46 g，加入少量去離子水溶解，再定容至1 000 mL。

pH 7.2：稱取磷酸氫二鈉0.68 g，磷酸二氫鉀0.25 g，加入少量去離子水溶解，再定容至1 000 mL。

1.3.3 涂片與觀察 取金銀花尺蠖老熟幼蟲10頭，用無菌水清洗后擦干，用解剖針將其腹部刺破， 用移液器取少量血液，滴在載玻片上涂成血膜，先用Wrights染液將血膜面充分覆蓋，稍等片刻再加Giemsa染液2～3滴，1 min后再緩慢地一滴一滴加磷酸鹽緩沖液（pH 7.2），直至膜面上染色液形成表面張力而終止加入。染色30 min后用自來水緩緩沖洗，涼干封片，在光學(xué)顯微鏡（BM2100型，南京江南永新光學(xué)有限公司）下觀察。

2 結(jié)果與分析

按照J(rèn)ones[14]的分類標(biāo)準(zhǔn)，通過光學(xué)顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)金銀花尺蠖老熟幼蟲的血細(xì)胞包括原血胞、漿血胞、粒血胞、珠血胞、類絳血胞和囊血胞6 種類型。這些血細(xì)胞在不同個體間形態(tài)與數(shù)量略有變化。

2.1 原血胞（Prohemocytes，PR）

原血胞也稱為原始血細(xì)胞，是數(shù)量較少的小型細(xì)胞，呈圓形或卵圓形，輪廓清晰，表面無突起，較光滑。細(xì)胞核為單核，紫紅色或紅色，位于細(xì)胞中央，比例很大，幾乎充滿整個細(xì)胞。細(xì)胞質(zhì)比較均勻，僅為薄薄的一層環(huán)繞在核周圍，無明顯顆粒狀物質(zhì)（圖1A）。一般認(rèn)為此類細(xì)胞為原始型，由造血器官或造血組織生成，可分化形成其他類型的血細(xì)胞，故名原血胞。

2.2 漿血胞（Plasmatocytes，PL）

漿血胞也稱為原生質(zhì)細(xì)胞，有球形、卵形、紡錘形、葉形及不規(guī)則形等多種形態(tài)，且大小不一。細(xì)胞核大，單核，位于細(xì)胞中央，約占細(xì)胞體積的一半。細(xì)胞質(zhì)均一，無顆粒內(nèi)含物（圖1 B、圖1C）。

2.3 粒血胞（Granulocytes，GR）

粒血胞是金銀花尺蠖幼蟲血淋巴中普遍存在的一種血細(xì)胞，在光學(xué)顯微鏡下易于辨識，呈圓形、卵圓形或不規(guī)則形狀。細(xì)胞核多為圓形和卵圓形，位于細(xì)胞中央，約占細(xì)胞體積的一半。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含較大的異質(zhì)性溶酶體顆粒，據(jù)此可與漿血胞相區(qū)分（圖1D）。

2.4 珠血胞（Sphrulocytes，SP）

珠血胞多為大中型細(xì)胞，呈圓形，細(xì)胞內(nèi)有大小不同、數(shù)目不等的珠形內(nèi)含物圍成一圈，細(xì)胞核難以觀察到（圖1E）。

2.5 類絳血胞（Oenocytoids，OE）

類絳血胞是金銀花尺蠖幼蟲血淋巴中最大型的血細(xì)胞，細(xì)胞外形不規(guī)則，細(xì)胞核較小，呈圓形，位于細(xì)胞的一側(cè)， 有的有2 個核，細(xì)胞質(zhì)濃厚而均勻（圖1F）。

2.6 囊血胞（Cystocytes，CY）

囊血胞多為中型細(xì)胞，呈圓形或橢圓形，細(xì)胞邊緣較光滑，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)具有大小不一的帶有折光性的顆?；驂K狀物（圖1 G）。

3 討論

昆蟲可產(chǎn)生多種類型的血細(xì)胞，通?？捎眯螒B(tài)、組織化學(xué)及功能特征來鑒別。血細(xì)胞的形態(tài)觀察是研究昆蟲細(xì)胞免疫反應(yīng)的基礎(chǔ)，國內(nèi)的昆蟲學(xué)工作者對多種昆蟲血細(xì)胞的形態(tài)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)了在不同種類的昆蟲中存在不同類型的血細(xì)胞，如劉玉濱等[15]利用掃描電鏡技術(shù)在華北大黑鰓金龜（Holotrichia oblita Fald.）3齡幼蟲血淋巴內(nèi)識別出5種類型的血細(xì)胞，分別是原血胞、漿血胞、顆粒血胞、珠血胞和凝血胞；遲淑萍等[16]利用瑞氏染色法在德國小蠊（Blattella germanica）血淋巴中發(fā)現(xiàn)原血胞、漿血胞、顆粒血胞、珠血胞和類絳血胞5種類型的血細(xì)胞；王世貴等[17]利用姬姆薩染色和光學(xué)顯微鏡在紅褐斑腿蝗（Catantops pinguis）血淋巴中發(fā)現(xiàn)了原血胞、漿血胞、粒血胞、珠血胞和囊血胞5種類型的血細(xì)胞；賈雷坡等[18]通過Wrights染色和光學(xué)顯微鏡對不同地區(qū)東亞飛蝗[Locusta migratoria manilensis（Meyen）]的血細(xì)胞進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)東亞飛蝗的血細(xì)胞包括原血胞、漿血胞、粒血胞及類絳血胞4種類型；晏容等[19]應(yīng)用姬姆薩染色結(jié)合相差顯微鏡及熒光染色方法在家蠅（Musca domestica）3齡幼蟲血淋巴中發(fā)現(xiàn)了原血胞、漿血胞、粒血胞、珠血胞及類絳血胞5種類型的血細(xì)胞；魏麗芳等[20]應(yīng)用熒光顯微鏡和掃描電鏡觀察識別出白蠟綿粉蚧（Phenacoccus fraxinus）血淋巴中有原血胞、漿血胞、粒血胞、類絳色血胞及囊血胞5種類型的血細(xì)胞。大量的研究表明，在鱗翅目昆蟲中有原血胞、漿血胞、粒血胞、珠血胞及類絳色血胞5種類型的血細(xì)胞[21]，筆者對鱗翅目昆蟲金銀花尺蠖幼蟲血細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)金銀花尺蠖幼蟲體內(nèi)存在原血胞、漿血胞、粒血胞、珠血胞、類絳色血胞及囊血胞6種類型的血細(xì)胞，這一結(jié)果進(jìn)一步說明了不同種類的昆蟲在不同的生長期血細(xì)胞種類均有差異。還需進(jìn)一步對金銀花尺蠖其他蟲態(tài)和不同發(fā)育齡期的血細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察比較，從而更加準(zhǔn)確地鑒定血細(xì)胞的類型。

血細(xì)胞在昆蟲免疫中具有重要地位，通過各種血細(xì)胞與體液因子的協(xié)同作用，對侵入體內(nèi)的病原體及異物發(fā)生明顯的免疫防御反應(yīng)。不同的血細(xì)胞具有不同的功能，原血胞無吞噬功能，但具有活躍的分裂增殖能力，并可轉(zhuǎn)化為漿血胞，其主要功能為分裂補充血細(xì)胞，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為此類細(xì)胞為原始型，由造血器官或造血組織生成，其他各類血細(xì)胞多由其衍生；漿血胞的主要功能是吞噬異物，同時也參與包被和成瘤作用，是主要的防衛(wèi)血細(xì)胞，并可轉(zhuǎn)化為粒血胞；粒血胞的主要功能是貯存代謝，此外還參與防衛(wèi)；珠血胞具有貯存和分泌作用，無吞噬功能；類絳血胞無吞噬功能，主要參與物質(zhì)代謝和分泌；囊血胞可能與昆蟲血淋巴的凝集和免疫有關(guān)[22，23]。

由于昆蟲的種類不同，對外來入侵物的細(xì)胞免疫反應(yīng)也不盡相同[8]，因此，還需深入研究金銀花尺蠖幼蟲的血細(xì)胞在免疫應(yīng)答中所起的作用，探討其血細(xì)胞免疫功能和作用機制，從而為金銀花尺蠖的防治提供理論指導(dǎo)。

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