李艷 王舒雅

摘要 [目的]研究?jī)?yōu)化用醇提法從榛蘑中提取粗多糖的工藝。[方法]以榛蘑為試材，通過(guò)L9（33）正交試驗(yàn)，研究了料液比、乙醇濃度、浸提時(shí)間對(duì)榛蘑粗多糖醇提提取率的影響。[結(jié)果]試驗(yàn)顯示，乙醇濃度和浸提時(shí)間是影響榛蘑粗多糖醇提提取率的主要因素，榛蘑粗多糖醇提最佳提取工藝為料液比1∶10，乙醇濃度30%，時(shí)間3 h。[結(jié)論]研究可為榛蘑粗多糖的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供參考。

關(guān)鍵詞 榛蘑；多糖；醇提；提取工藝

中圖分類(lèi)號(hào) S646 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）31-11100-02

Study on Ethanol Extraction Technology of Crude Polysaccharides from Armillariella mellea

LI Yan， WANG Shuya

（School of Life Science & Chemistry， Hulunber College， Hulunber， Inner Mongolia 021008）

Abstract [Objective] To optimize ethanol extraction technology of crude polysaccharides from Armillariella mellea. [Method] The effect of the ratio of material to liquid， ethanol concentration， extraction time on the extraction rate of crude polysaccharides from Armillariella mellea was studied through L9（33）orthogonal test. [Result] The results showed that ethanol concentration and extraction time are the main factors influencing the extraction rate of crude polysaccharides from Armillariella mellea. The optimum extraction processes were the ratio of solid to liquid 1∶10， ethanol concentration 30%， time of 3 h. [Conclusion] The study can provide reference for further development and utilization of crude polysaccharide from Armillariella mellea.

Key words Armillariella mellea； Polysaccharide； Ethanol extract； Extraction process

多糖是由單糖基通過(guò)糖苷鍵連接起來(lái)的。藥理研究表明，植物多糖具有抗病毒、抗輻射、抗腫瘤、延緩衰老及增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)等作用，且某些多糖還具有降血脂、降血糖等作用，有的多糖還能誘導(dǎo)干擾素的產(chǎn)生^[1-2]。近年來(lái)，植物、海洋生物及菌類(lèi)等來(lái)源的多糖已作為有生物活性的天然產(chǎn)物中的一個(gè)重要類(lèi)型出現(xiàn)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，已有100種植物的多糖被分離提取出來(lái)^[3]。

榛蘑營(yíng)養(yǎng)豐富，富含大量鈣、磷、鐵、蛋白質(zhì)、糖類(lèi)、胡蘿卜素、維生素C等微量元素和營(yíng)養(yǎng)成分，是一般蔬菜的十幾倍。榛蘑含有人體必需的多種氨基酸和維生素，具有抗癌防癌、防治某些呼吸道及消化道感染疾病、防治病毒性疾病、降低膽固醇、防止動(dòng)脈硬化、穩(wěn)定血壓等功能，它對(duì)預(yù)防視力減退、夜盲也很有效果。近年來(lái)對(duì)多糖提取工藝的研究方法較多^[4-6]，如熱水浸提法、醇浸提法、稀堿液浸提法、稀酸液浸提法^[7-8]。但用醇提法從榛蘑中提取粗多糖的工藝研究還鮮見(jiàn)報(bào)道。同時(shí)因?yàn)樵谙∷?、稀堿條件下，易使多糖發(fā)生糖苷鍵的斷裂，部分多糖發(fā)生水解而使多糖的提取率減少，因此筆者采用乙醇浸提法提取榛蘑粗多糖。

1 材料與方法

1.1 材料

原料：榛蘑，產(chǎn)于黑龍江三江平原地區(qū)。

主要試劑：無(wú)水乙醇、95% 乙醇、丙酮、無(wú)水乙醚、蒽酮、濃硫酸、葡萄糖、三氯甲烷、正丁醇，均為分析純，沈陽(yáng)試劑廠。

主要儀器：DS1高速組織搗碎機(jī)，上海標(biāo)本模型廠；電熱恒溫干燥箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國(guó)華電器有限公司；752N型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；JA5003N型電子天平；

SHBⅢ型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

1.2 多糖的提取流程

將榛蘑原料水洗，在60 ℃烘干至恒重后將其粉碎，用90%乙醇脫脂，干燥，然后加入一定量一定濃度的乙醇，浸泡一定時(shí)間后提取，抽濾，重復(fù)3次，收集提取液棄去殘?jiān)?。提取液蒸發(fā)濃縮至原體積的1/4得到濃縮液，濃縮液用2.5倍量95%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）乙醇醇析得粗多糖沉淀，離心，干燥后得未除蛋白的粗多糖產(chǎn)品。

1.3 粗多糖中蛋白質(zhì)的去除

該試驗(yàn)采用Savage法脫蛋白。Savage法是利用蛋白質(zhì)遇有機(jī)溶劑變性而不溶于水的特點(diǎn)而分離除去。用少量蒸餾水溶解粗多糖混勻后按4∶1的比例加入氯仿-正丁醇（4∶1）混合液，振搖20 min，可見(jiàn)凝膠狀的蛋白質(zhì)析出，用離心法除去，直至無(wú)乳白色變性蛋白質(zhì)析出為止。

1.4 醇沉、洗滌

將除蛋白后的多糖溶液緩慢倒入3倍體積的95%乙醇中，4 ℃冰箱中醇沉24 h后取出，離心后取沉淀用95%乙醇、無(wú)水乙醇淋洗1次，丙酮、無(wú)水乙醚各淋洗2次后干燥，稱(chēng)重。

1.5 多糖含量的測(cè)定

該試驗(yàn)采用蒽酮-硫酸法測(cè)定總的多糖含量^[9-11]。蒽酮-硫酸法是利用糖類(lèi)遇濃硫酸脫水生成糖醛或其衍生物，可與蒽酮試劑縮合產(chǎn)生有色物質(zhì)，反應(yīng)后溶液呈藍(lán)綠色，于波長(zhǎng)620 nm處有最大吸收。該試驗(yàn)先利用標(biāo)準(zhǔn)糖溶液將其用蒽酮試劑處理后在波長(zhǎng)620 nm處的吸光度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，再測(cè)定待測(cè)樣品溶液的吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算出多糖含量。

1.5.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。

取6 只具塞試管，分別加入100 μg/ml 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75 ml，以蒸餾水補(bǔ)充至2 ml，每管內(nèi)含葡萄糖分別為0、15、30、45、60、75 μg。加入4 ml蒽酮試劑，搖勻，沸水浴加熱15 min后取出，流動(dòng)水冷卻，用1 cm比色皿，在752N型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上測(cè)定A620，重復(fù)測(cè)定3次取平均值。以葡萄糖量（μg）為橫坐標(biāo)，A620為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.2 樣品糖含量的測(cè)定。

取制得的粗多糖樣品30 mg，蒸餾水溶解并定容到250 ml容量瓶中，充分混勻，從中取出2.00 ml溶液并加入4.00 ml蒽酮試劑，搖勻，沸水浴加熱15 min，反應(yīng)完畢后流動(dòng)水冷卻，在752N型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上測(cè)定A620值。以2 ml水代替樣品液，如上操作并作為空白對(duì)照。重復(fù)測(cè)定3次，取平均值。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中糖含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖含量的測(cè)定

在試驗(yàn)條件下，測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)見(jiàn)表1，并以葡萄糖量（μg）為橫坐標(biāo)，A620為縱坐標(biāo)作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

回歸方程為：

Y=0.006X+0.001 1（相關(guān)系數(shù)R=0.999 8）。

多糖純度（%）=[ 125X/（G×1 000）]×100%

式中，X為從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得A620對(duì)應(yīng)之樣品的糖量（μg）；

G為測(cè)試樣品的質(zhì)量（mg）。

2.2 醇提提取榛蘑中可溶性多糖提取率的正交試驗(yàn)

2.2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果的直觀分析。

要得到較高的提取率，就必須選擇合適的提取條件。通過(guò)查閱資料得知影響多糖醇提提取的主要因素是：浸提的料液比、乙醇濃度和浸提時(shí)間。浸提料液比的選擇依據(jù)：一般來(lái)說(shuō)只要能將活性物質(zhì)溶出，料液比中溶劑用量越小越好，因?yàn)榱弦罕戎腥軇┯昧窟^(guò)大時(shí)，會(huì)給以后的濃縮帶來(lái)不便。乙醇濃度的選擇依據(jù)：當(dāng)乙醇濃度超過(guò)40%時(shí)，乙醇濃度增大，多糖得率急劇減小。這是因?yàn)轶w系的極性隨乙醇濃度的增大而減小，由于“相似相溶”的緣故，所以具有極性的大分子多糖不易提取出來(lái)。浸提時(shí)間的選擇依據(jù)：延長(zhǎng)提取時(shí)間會(huì)提高提取率，但當(dāng)細(xì)胞中的有效成分已完全溶出時(shí)，延長(zhǎng)提取時(shí)間非但不能提高提取率，反而會(huì)增加提取液中雜質(zhì)的含量^[12]。

由于上述原因，該試驗(yàn)選取浸提的料液比、乙醇濃度和浸提的時(shí)間3個(gè)因素。料液比（干燥樣品的質(zhì)量與乙醇溶液的質(zhì)量之比）采用1∶5、1∶10、1∶15 3個(gè)水平，浸提乙醇濃度采用30%、40%、50% 3個(gè)水平，浸提時(shí)間采用1、2、3 h 3個(gè)水平做正交試驗(yàn)^[13]，因素水平見(jiàn)表2，試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算及分析見(jiàn)表3。

從表3可知，乙醇濃度和浸提時(shí)間是影響榛蘑多糖醇提提取率的關(guān)鍵因素，在試驗(yàn)范圍內(nèi)，料液比的影響最小。榛蘑醇提提取工藝最優(yōu)條件為A2B1C3，即料液比1∶10，乙醇濃度30%，提取時(shí)間3 h。

2.2.2 正交試驗(yàn)的方差分析結(jié)果。

正交試驗(yàn)的方差分析得出，F(xiàn)A=0.330，F(xiàn)B=1.121，F(xiàn)C=1.549，F(xiàn)臨界值=5.140。由此看出，乙醇濃度和浸提時(shí)間的差異顯著，對(duì)榛蘑多糖醇提提取率的影響起主要作用，料液比在此試驗(yàn)范圍內(nèi)沒(méi)有顯著性差異，對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響較小。這與直觀分析結(jié)果是相吻合的。

3 結(jié)論

該研究通過(guò)正交試驗(yàn)得到了榛蘑粗多糖醇提提取最佳的工藝條件，即料液比1∶10，乙醇濃度30%，時(shí)間3 h。乙醇濃度和浸提時(shí)間是影響榛蘑多糖醇提提取率的關(guān)鍵因素，在試驗(yàn)范圍內(nèi)，料液比的影響最小。

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