王林濤 姚笛

摘要 [目的]研究畢赤酵母菌株（Pichia GS115）表達人C型溶菌酶（HLYZ）的發(fā)酵與分離純化的工藝。[方法]探討酵母生長規(guī)律，研究不同菌體濃度、不同誘導時間對蛋白產量的影響，并且探討不同pH條件對DEAESepharose FF和CMSepharose FF層析分離純化目標蛋白的影響。[結果] 畢赤酵母菌株表達HLYZ的最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵24 h用濃度1%甲醇誘導，以后每12 h用濃度1%甲醇誘導，共6次，在此條件下可獲得高產量目標蛋白。DEAESepharose FF和CMSepharose FF分離純化目標蛋白的最佳pH 分別為6.65和6.50。[結論]該研究可為人C型溶菌酶的工藝化生產提供理論指導。

關鍵詞 人C型溶菌酶；畢赤酵母；發(fā)酵；DEAE與CM層析

中圖分類號 S188+.3 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）31-10836-03

Study of the Human Ctype Lysozyme Fermentation， Separation and Purification

WANG Lintao1， YAO Di2

（1. School of Life Sciences， Fudan University， Shanghai 200433； 2. Changzhou Technican College， Changzhou， Jiangsu 213017）

Abstract [Objective] To study the fermentation， separation and purification of human ctype lysozyme from Pichia yeast strain （Pichia GS115）. [Method] The effections of different cell concentration and different induction time on the protein production were investigated. The effection of the pH conditions on the DEAESepharose FF and CMSepharose FF chromatography separation and purification of the target protein were also investigated. [Result] It was found that optimal fermentation conditions for human ctype lysozyme were as follows： induction with 1% methanol after 24 h fermentation， next， induction with 1% methanol every 12 h， six times. Under the above conditions， high yield of the target proteins were obtained. The optimal pH conditions for the DEAESepharose FF and CMSepharose FF separation and purification are 6.65 and 6.5. [Conclusion] The research provides theoretical guidance for the industrial production of human ctype lysozyme from Pichia yeast strain （Pichia GS115）.

Key words Human ctype lysozyme； Pichia yeast； Fermentation； DEAESepharose FF and CMSepharose FF

C型人溶菌酶（HLYZ）由英國著名科學家弗萊明^[1]發(fā)現，是一種1，4βN溶菌酶。它切割細菌細胞壁肽聚糖N乙酰胞壁酸（MurNAc）和N乙酰葡萄糖胺（GlcNAcC4）之間的糖苷鍵，破壞肽聚糖骨架，在細菌內部滲透壓作用下導致細菌破裂達到殺菌效果^[2]。HLYZ廣泛存在于人體的體液、細胞及組織器官中^[3]，可見其對人體的重要性。HLYZ有著獨特的優(yōu)越性和非常多的藥理作用，具有多重臨床應用價值^[4-8]。鑒于其重要的生理作用，目前國外對HLYZ的制備過程進行了廣泛的研究與開發(fā)，所采用的HLYZ表達的宿主菌大多為畢赤酵母GS115菌株，以pPIC9K為載體，可以獲得對HLYZ的高表達^[9]。

國內采用畢赤酵母發(fā)酵生產HLYZ的報道較少，有利用大腸桿茵、酵母茵和真茵表達系統(tǒng)表達HLYZ，最高水平為40 mg/L^[10]。筆者采用畢赤酵母GS115菌株表達HLYZ，分別研究不同菌體濃度、不同誘導時間對蛋白產量的影響，得出可獲得高產量HLYZ的發(fā)酵條件。近年來，有利用離子交換層析分離純化人溶菌酶研究的報道^[11-12]。筆者在不同pH條件下對HLYZ進行DEAESepharose FF及CMSepharose FF層析分離純化研究。在SDSPAGE電泳檢測結果，清晰可見單一目標蛋白條帶，分離純化效果非常好。該研究為實現HLYZ規(guī)模化生產提供了參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株。含pPIC9K/HLYZ載體的畢赤酵母菌GS115HLYZ重組菌株，由研究室構建和保存；HLYZ活性測定用溶壁微球菌AS 1.634，購自中國科學院微生物研究所。

1.1.2 培養(yǎng)基。斜面培養(yǎng)基為YPDG418培養(yǎng)基，組成為：蛋白胨2%，酵母提取物1%，葡萄糖2%，瓊脂2%；搖瓶和發(fā)酵培養(yǎng)基為BMGY培養(yǎng)基，組成為：蛋白胨2%，酵母提取物1%，磷酸緩沖液0.1mol/L（pH 6.0），酵母氮源培養(yǎng)基（YNB）1.34%，生物素0.4 mg/L，甘油2%。

1.1.3 層析劑。DEAESepharose FF，CMSepharose FF，購自GE Healthcare公司。

1.2 方法

1.2.1 搖瓶培養(yǎng)。

從-70 ℃冷凍冰箱取出冷凍菌液，接種于YPDG418斜面上培養(yǎng)24 h，接一級種于120 ℃、20 min滅菌的裝量為500 ml BMGY培養(yǎng)基的2 000 ml三角搖瓶中，30 ℃，200 r/min搖床培養(yǎng)16 h。

1.2.2 發(fā)酵及誘導表達。將500 ml搖瓶種子接種到120 ℃，20 min滅菌的裝量10 L BMGY培養(yǎng)基的15 L發(fā)酵罐中發(fā)酵，發(fā)酵溫度30 ℃，pH用濃度12%氨水、2 mol/L鹽酸控制在5.5，溶解氧（DO）控制在10%～15%相對飽和濃度，細胞生長36 h或24 h后加濃度1%甲醇誘導表達HLYZ蛋白，其后定時多次加濃度1%甲醇誘導。

1.2.3 分析方法。

1.2.3.1 菌體量的測定。以純水為對照，發(fā)酵液稀釋后在波長600 nm處比色，測定吸光度。

1.2.3.2 HLYZ活性的測定。將搖瓶培養(yǎng)的溶壁微球菌懸混于0.1 mol/L PBS中，配制成光密度為1.0（可見光分光光度計測定，λ530）濃度的菌體溶液。取畢赤酵母發(fā)酵液離心上清液0.75 ml于裝有3 ml已配制的恒溫30 ℃的溶壁微球菌的比色皿中，立即搖勻，記錄可見光分光光度計（λ430）1 min的光密度數變化。酶活單位為光密度每下降0.001即為一個酶活單位。

1.2.3.3 分離純化HLYZ得率的計算。分離、純化后得到的收集液HLYZ活性總量與分離前樣品HLYZ活性總量之比。

1.2.3.4 目標蛋白分子量的測定。采用SDSPAGE電泳，測定分離純化溶液過程中目標蛋白。

1.2.4 發(fā)酵液預處理。

發(fā)酵結束后立即4 ℃，4 000 r/min離心分離菌體，取上清液于-18 ℃冰箱保存。

1.2.5 DEAE sepharose層析分離純化。DEAESepharose FF粉狀顆粒經0.1 mol/L PBS（pH 7.5）溶液平衡2 h，裝柱（10 mm×220 mm），在BioRad常壓層析儀上層析，10 ml發(fā)酵液上柱，速度1 ml/min，收集流出液，在λ280處測定出峰的流出液HLYZ活性，合并活性收集液。

1.2.6 CMSepharose FF層析分離純化。

CMSepharose FF粉狀顆粒經0.1 mol/L PBS（pH 7.5）溶液平衡2 h，裝柱（10 mm×220 mm），在BioRad常壓層析儀上層析，20 ml DEAESepharose FF收集液上柱，速度1 ml/min，用pH 7.5 PBS沖洗，直至沖完所有出峰，不收集；用2 mol/L NaCl的pH 7.5 PBS洗脫柱，收集第2個出峰。在λ280處測定第2個出峰的流出液HLYZ活性，合并活性收集液。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵條件及HLYZ產量

2.1.1 菌體濃度對HLYZ產量的影響。

BMGY培養(yǎng)基發(fā)酵，菌體培養(yǎng)36 h后每24 h加濃度1%甲醇誘導，測定菌體濃度和HLYZ活性。BMGY培養(yǎng)基中碳氮比不合適，使得菌體濃度生長受到限制。在BMGY基礎上流加甘油，直至菌體生長到最大濃度，在較高菌體濃度下誘導HLYZ表達。從圖1和圖2可以看出，在菌體濃度A600達到32時比A600 達到15時HLYZ活性高出1.8倍。因此，在發(fā)酵菌體高濃度下HLYZ產量增加。

2.1.2 誘導時間對HLYZ產量的影響。

HLYZ活性在誘導12 h后不再增加，甚至活性出現下降。這可能是HLYZ被蛋白酶分解的原因。因此，在菌體生長24 h達到最高濃度后開始誘導，每12 h誘導1次，直至誘導后HLYZ活性不再增加。從圖3可以看出，在對甲醇誘導時間縮短至12 h以及增加誘導次數的情況下，HLYZ產量大大提高，在同等菌體濃度下發(fā)酵產量提高1.6倍。

2.2 HLYZ分離純化

2.2.1 DEAESepharose FF分離純化。

離子交換層析分離蛋白質離子時pH對分離效果、得率有很大的影響。在不同pH下對發(fā)酵液進行蛋白層析分離。

從表1可以看出，在其他條件不變的情況下，隨著pH的提高，HLYZ活性先上升，在pH 6.65左右達到較高值，此時目標蛋白得率最高。蛋白質分離效果見圖4。

2.2.2 CMSepharose FF分離純化。

從表2可以看出，在其他條件不變的情況下，隨著pH的提高，HLYZ活性先上升，在pH6.5左右達到較高值，此時目標蛋白得率最高。圖5顯示蛋白分離效果。CM分離純化后SDSPAGE凝膠電泳實驗檢測見圖6。

3 結論與討論

通過不同菌體濃度、甲醇誘導時間2個因素對HLYZ發(fā)

酵條件進行優(yōu)化，發(fā)現在發(fā)酵菌體高濃度下HLYZ產量增加。在將甲醇誘導時間縮短至12 h以及增加誘導次數的情況下，HLYZ產量大大提高，在同等菌體濃度下發(fā)酵產量提高1.6倍。在發(fā)酵過程中影響HLYZ產量的因素還有很多，如碳源、氮源濃度、pH、溫度等。該研究僅對菌體濃度及甲醇誘導時間2個因素加以分析，因此想要規(guī)?；aHLYZ，還有待進一步分析。

利用DEAESepharose FF和CMSepharose FF在不同pH下對HLYZ進行分離純化。研究表明，在 pH 6.65下DEAESepharose FF和pH 6.5下CMSepharose FF對目標蛋白分離純化得率最高；DEAESepharose FF分離純化雜峰較多，進一步進行CMSepharose FF層析僅一個雜峰。經DEAE和CM分離純化后，通過SDSPAGE凝膠電泳實驗檢測，發(fā)現在14.6 kDa處有一條清晰可見的單一條帶，幾乎沒有其他雜帶，說明分離效果非常好，最后經過冷凍干燥得到蛋白凍干粉，其比活可以達到52 000 U/mg。

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