葉俊華 解士海 楊觀招

【摘要】目的 研究氫化可的松對人表皮共培養(yǎng)體系（黑素細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞）酪氨酸酶活性及黑素生成的影響。 方法 培養(yǎng)人表皮黑素細(xì)胞和人表皮黑素細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞共培養(yǎng)體系，利用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)還原法測定細(xì)胞活力，測定酪氨酸酶活性，475nm 比色法測定黑素含量。 結(jié)果 10-7mol/L、10-6μmol/L和10-5mol/L氫化可的松對于黑素細(xì)胞及共培養(yǎng)細(xì)胞酪氨酸酶活性及黑素生成均有較強(qiáng)的劑量相關(guān)性增強(qiáng)作用， 10-6μmol/L和10-5mol/L氫化可的松與對照組相比有顯著差異（p<0.01）。結(jié)論 氫化可的松對于共培養(yǎng)體系酪氨酸酶活性及黑素生成有較強(qiáng)的劑量相關(guān)性增強(qiáng)作用。

【關(guān)鍵詞】 氫化可的松 黑素細(xì)胞 角質(zhì)形成細(xì)胞 共培養(yǎng)

【Abstract】Objective To study the effects of hydrocrtison on the tyrosinase activity and melanogenesis in co-culture model of human melanocytes and keratinocytes. Methods The model of co-culture of human melanocytes and keratinocytes was cultured and MTT was used to measure the proliferation of melanocytes and the co-cultures.The tyrosinase activity and melanin content were measured. Results The melanin synthesis and tyrosinase activity were clearly enhanced by hydrocrtison in a dose-dependent manner at concentrations of 10-7mol/L、10-6μmol/Land 10-5mol/L in both melanocytes and co-cultures. 10-6μmol/Land 10-5mol/L of hydrocrtison showed statistically significant suppression (p<0.01) than the control.Conclusion Hydrocrtison exhibits a a dose-dependent enhancing effects on melanin synthesis and tyrosinase activity in co-cultures of human melanocytes and keratinocytes.

【key words 】Hydrocrtison Melanocte Keratinocyte Co-culture

【中圖分類號】R722.12 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】B【文章編號】1004-4949(2014)07-0054-02

白癜風(fēng)是指后天獲得的色素完全脫失的一種皮膚病，近年來其發(fā)病有上升趨勢。白癜風(fēng)雖然不直接危害患者生命，但是泛發(fā)嚴(yán)重的白癜風(fēng)會對患者心理產(chǎn)生嚴(yán)重的損害，因此針對白癜風(fēng)的有效治療就很有必要，但是目前臨床尚無根治白癜風(fēng)的特效療法。其發(fā)病機(jī)制涉及遺傳、免疫、黑素細(xì)胞自身死亡以及神經(jīng)等多方面因素，尚無定論。臨床上無論內(nèi)服還是外用糖皮質(zhì)激素都可以有效治療白癜風(fēng)，本研究在人表皮黑素細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞共培養(yǎng)體系中研究氫化可的松對于黑素合成的影響，試圖揭示糖皮質(zhì)激素治療白癜風(fēng)的機(jī)制。

材料和方法

1 材料：氫化可的松：購自中國藥品生物制品檢定所，氫化可的松溶解在0.1%乙醇中，-20oC保存，實(shí)驗(yàn)時用培養(yǎng)基調(diào)制最終濃度； M154基礎(chǔ)培養(yǎng)基、角質(zhì)形成細(xì)胞生長添加物購自Cascade Biologicals，胎牛血清購自杭州四季青公司，其它（氫醌、二甲基亞砜（DMSO）、10－8mol/Lα－MSH、四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）、1％抗生素/抗真菌溶液、1μg/mL轉(zhuǎn)移因子、中性酶、胰酶、1μg/mL 維生素E、5μg/mL 胰島素、0.6ng/mL人堿性成纖維細(xì)胞生長因子、10－9mol/L ET-1）購自Sigma公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1皮膚來源：均來源于中國青少年男性常規(guī)包皮環(huán)切術(shù)后的包皮。

2.2 黑素細(xì)胞培養(yǎng)：細(xì)胞培養(yǎng)參考以前方法進(jìn)行［1］。

2.3共培養(yǎng)體系的建立：參見我們已報道文獻(xiàn)［2］,簡述如下：首先分別培養(yǎng)原代角質(zhì)形成細(xì)胞和原代黑素細(xì)胞，取2到3代的細(xì)胞用于試驗(yàn)，將培養(yǎng)好角質(zhì)形成細(xì)胞的和黑素細(xì)胞按照2：1混和接種，共同培養(yǎng)，其培養(yǎng)基為角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基和黑素細(xì)胞培養(yǎng)基按2：1混合而得。

2.4 MTT實(shí)驗(yàn)：將共培養(yǎng)細(xì)胞及黑素細(xì)胞按1×104/孔接種于96孔板，氫化可的松設(shè)7個濃度（10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L、10-4mol/L、10-3mol/L），每一濃度設(shè)4個復(fù)孔，對照組直接加共培養(yǎng)培養(yǎng)基200μL，空白孔不加細(xì)胞，只加培養(yǎng)基，經(jīng)過一定時間和條件的培養(yǎng)，具體可參考以前的實(shí)驗(yàn)，在酶標(biāo)儀490nm波長（參考波長620nm）下測量各孔吸光度值，細(xì)胞增殖率＝［（待篩物各濃度平均吸光度值－空白組平均吸光度值）/（對照組平均吸光度值－空白組平均吸光度值）］×100％。

2.5酪氨酸酶活性檢測 ［3］：將培養(yǎng)細(xì)胞按1×104/孔接種于96孔板，分別加入含不同濃度藥物培養(yǎng)基100μL，對照組只加培養(yǎng)基，空白組不加細(xì)胞，陽性對照為5μmol/L8-MOP（8甲氧補(bǔ)骨脂素），依據(jù)對培養(yǎng)細(xì)胞無毒性原則選取3個濃度（10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L），經(jīng)過一定時間和條件的培養(yǎng)，具體可參考以前的實(shí)驗(yàn)，在酶標(biāo)儀490nm波長（參考波長620nm）下測量各孔吸光度值，酪氨酸酶活性影響率＝［（待篩物組平均吸光度－空白組平均吸光度）/（對照組平均吸光度－空白組平均吸光度）］×100％。

2.6 黑素含量測定實(shí)驗(yàn)［4］：在60mm直徑的培養(yǎng)皿中接種培養(yǎng)細(xì)胞，加入含不同濃度藥物的相應(yīng)培養(yǎng)基，對照組只加培養(yǎng)基，陽性對照同酪氨酸酶活性測定實(shí)驗(yàn)，氫化可的松根濃度選取同上（10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L），經(jīng)過一定時間和條件的培養(yǎng)，具體可參考以前的實(shí)驗(yàn)，分光光度計(jì)下測量475nm（參比波長620nm）的吸光度，黑素含量＝［（待篩物組吸光度/細(xì)胞數(shù)的平均值）/（對照組吸光度/細(xì)胞數(shù)的平均值）］ ×100％，重復(fù)4次。

2.7 數(shù)據(jù)處理：采用SPSS12.0軟件t檢驗(yàn)分析，數(shù)據(jù)以 X±s 表示。

結(jié)果

1氫化可的松對細(xì)胞活力的影響：氫化可的松在（10-9mol/L－10-5mol/L）濃度范圍內(nèi)經(jīng)MTT實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證對所有實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)細(xì)胞增殖都無影響。

2氫化可的松對黑素細(xì)胞及共培養(yǎng)細(xì)胞酪氨酸酶活性的影響：結(jié)果見表1，氫化可的松對于實(shí)驗(yàn)細(xì)胞酪氨酸酶活性呈劑量依賴性增強(qiáng)作用，與對照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.05），10-6mol/L及10-5mol/L濃度的氫化可的松具有顯著差異（p<0.01），氫化可的松對于兩種實(shí)驗(yàn)細(xì)胞中酪氨酸酶活性的增強(qiáng)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別（p>0.05）。

表1氫化可的松對黑素細(xì)胞及共培養(yǎng)細(xì)胞中酪氨酸酶活性影響 (n=3， X±s，％)

Table one The effects of hydrocrtison on the tyrosinase activity in co-culture system (n=3， X±s，％)

濃度 (mol/L)concentrations 黑素細(xì)胞melanocyte 共培養(yǎng)細(xì)胞co-culture system10-7 124.67±6.43＃ 128.82±4.91＃10-6 171.28±9.59＃＃ 165.15±6.68＃＃10-5 202.58±11.29＃＃ 199.39±8.27＃＃5μmol/L 8-MOP 176.43±7.33＃＃ 169.43±8.92＃＃注：空白對照組相應(yīng)值設(shè)為100%，與空白對照組相比：＃p<0.05， ＃＃p<0.01。

1氫化可的松對黑素細(xì)胞及共培養(yǎng)細(xì)胞黑素含量的影響：結(jié)果見表2，氫化可的松對于實(shí)驗(yàn)細(xì)胞中黑素合成呈劑量依賴性增強(qiáng)作用，與對照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.05），10-6mol/L及10-5mol/L濃度的氫化可的松具有顯著差異（p<0.01），氫化可的松對于實(shí)驗(yàn)中兩種細(xì)胞的黑素合成增強(qiáng)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別（p>0.05）。

表2氫化可的松對黑素細(xì)胞及共培養(yǎng)細(xì)胞中黑素合成影響 (n=3， X±s，％)

Table two The effects of hydrocrtison on melanogenesis in co-culture system (n=3， X±s，％)

濃度 (mol/L)Concentrations 黑素細(xì)胞melanocyte 共培養(yǎng)細(xì)胞co-culture system10-7 127.53±9.12＃ 125.69±9.35＃10-6 167.24±11.57＃＃ 166.38±8.17＃＃10-5 198.26±10.28＃＃ 191.21±10.44＃＃5μmol/L 8-MOP 171.12±8.85＃＃ 178.87±12.17＃＃注：空白對照組相應(yīng)值設(shè)為100%，與空白對照組相比：＃p<0.05， ＃＃p<0.01

討 論

糖皮質(zhì)激素用于治療白癜風(fēng)已經(jīng)超過50年，臨床療效確定，而且強(qiáng)效糖皮質(zhì)激素激素作用強(qiáng)于弱效激素。其機(jī)理尚未明確。由于自身免疫紊亂以及黑素細(xì)胞抗體產(chǎn)生可能是白癜風(fēng)發(fā)病的重要原因，糖皮質(zhì)激素可能通過調(diào)節(jié)這兩方面的作用達(dá)到治療白癜風(fēng)的目的。近年來一些研究同樣發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素還可以直接作用于黑素細(xì)胞，引起酪氨酸酶活性增加以及黑素含量增加，如劉棟［5］等研究發(fā)現(xiàn)氫化可的松可以增強(qiáng)Cloudman S91黑素瘤細(xì)胞的酪氨酸酶活性并增加其黑素合成；鄧瑞春［6］等發(fā)現(xiàn)氫化可的松在B16黑素瘤細(xì)胞中有類似作用，類似的結(jié)果也在A375黑素瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)［7］。這些說明糖皮質(zhì)激素還可能通過增強(qiáng)黑素合成發(fā)揮作用。

隨著近年來黑素細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的成熟，人們逐漸用人表皮黑素細(xì)胞以及更接近人體的人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞和黑素細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)研究黑素合成轉(zhuǎn)移的過程以及各種影響因素。本試驗(yàn)采用了這兩種體系進(jìn)一步研究了氫化可的松對于正常人表皮黑素生成的影響，發(fā)現(xiàn)氫化可的松可以在一定濃度范圍內(nèi)劑量依賴地提高酪氨酸酶的活性并增加黑素的合成。這個結(jié)果進(jìn)一步說明氫化可的松除了通過免疫途徑外，還可通過增強(qiáng)黑素合成達(dá)到治療效果。

參考文獻(xiàn)

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［2］ 解士海;黃壯峰;楊觀招等。氧化苦參堿對細(xì)胞共培養(yǎng)體系中酪氨酸酶及黑素的影響。中國熱帶醫(yī)學(xué)，2008,8（8）：1291-92

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［6］鄧瑞春，周勇，章金剛等，氫化可的松對B16黑素瘤細(xì)胞酪氨酸酶及黑素生成影響的研究。中國藥理學(xué)通報，2002,18（4）：433-6

［7］ 韓景濤，袁江，劉志軍。氫化可的松對A375黑素瘤細(xì)胞黑素生成的影響。中國美容醫(yī)學(xué)，2007,16（12）：1699-1700