廖楊玲

【摘要】目的：建立以HPLC法測定上清丸中大黃酸、大黃素、大黃酚含量的方法。方法：采用Symmetry C18柱，以甲醇-0.1%磷酸=80:20為流動相，檢測波長：430nm，流速1.0mL?min-1，柱溫:室溫。結果：大黃酸、大黃素、大黃酚分別在7.92～79.2ng（r=0.9998）、14.5～145ng（r=0.9991）、27.24～272.4ng（r=0.9994）線性關系良好，平均加樣回收率分別為99.7%、99.2%、99.4%，RSD分別為0.95%、1.25%、1.27%。結論：本方法操作簡便、靈敏度高、重現(xiàn)性好，適用于上清丸中大黃酸、大黃素和大黃酚的含量測定。

【關鍵詞】高效液相色譜法；上清丸； 大黃酸、大黃素、大黃酚

【Abstract】Objective: To establish a HPLC for determination of rhein、emodin、chrysophanol in Shangqing Pills. Method: A Symmetry C18 Column was used. The mobile phase was methanol-0.1% Phosphoric Acid =80:20， the detecting wavelength was at 430nm，the flow rate was 1.0mL?min-1，the column temperature was room temperature. Result: The linear relationship of rhein、emodin、chrysophanol were 7.92～79.2ng（r=0.9998）、14.5～145ng（r=0.9991）、27.24～272.4ng（r=0.9994）, the recoveries were 99.7%, 99.2%, and 99.4%,respectively, the RSD were 0.95%, 1.25%, and 1.27%,respectively. Conclusion: This method was easy and simple to handle, has good repeatability, flexibility and high sensitivity. It can be used for the determination of rhein、emodin、chrysophanol in Shangqing pills.

【key words 】HPLC; Shangqing pills; rhein; emodin; chrysophanol

【中圖分類號】R927.2 【文獻標識碼】B【文章編號】1004-4949(2014)07-0007-01

上清丸由菊花、白芷、黃芩、黃柏等12味藥而制成的大蜜丸，收載于《衛(wèi)生部藥品標準中藥成方制劑第十冊》，具有清熱散風、解毒、通便等功效，對頭暈耳鳴、目赤、鼻竇炎、通便等有很好的作用［1］。目前的標準中只有丸劑的通則檢查，尚無定性定量指標，而目前的文獻報道主要對其方中的大黃、黃柏進行定性鑒別［2］，或者對黃芩苷［2］、小檗堿［3］進行含量控制，但為了有效控制質量，我們認為控制方中主藥大黃中的大黃酸、大黃素和大黃酚的含量更有意義。我們查閱相關文獻［4－9］并改進，采用高效液相色譜法測定上清丸中大黃酸、大黃素和大黃酚的含量，現(xiàn)報道如下。

1.儀器與試藥

美國Waters高效液相色譜儀（1525二元泵，2487雙通道檢測器，717自動進樣器，Empower色譜工作站）；色譜柱：Symmetry C18（4.6mm×150mm，5μm）。SG3300HP超聲波清洗器（上海冠特超聲儀器有限公司）； KQ3000超聲波清洗器（昆山舒美超聲儀器有限公司）；WX-80A微型旋渦混合儀（上海滬西儀器有限公司）；BT25S電子天平（精度0.01mg，德國賽多利斯科學儀器有限公司）；FA1104電子天平（精度0.1mg，上海舜宇恒平儀器有限公司）。

大黃酸對照品（批號：0757-200206）、大黃素對照品（批號：110756-200110）、大黃酚對照品（批號：110796-200412）均購自中國藥品生物制品檢定所，均為供含量測定用。上清丸產自湖南XX制藥股份有限公司（批號：20120906、20121101、20130305，規(guī)格：9克?丸－1）；甲醇、磷酸為色譜純，水為超純水；其他試劑為分析純。

2、方法與結果

2.1色譜條件

色譜條件：Symmetry C18（4.6mm×150mm，5μm），流動相：甲醇－0.1%磷酸=80:20；流速：1.0mL?min-1；檢測波長：430nm；柱溫: 室溫；進樣量:10μL。

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液的制備分別精密稱取經五氧化二磷減壓干燥至恒重的大黃酸、大黃素、大黃酚對照品4.46、8.25、13.62 mg，分別置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為儲備液。精密量取大黃酸、大黃素、大黃酚對照品儲備液各1 mL，置同一10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成含大黃酸、大黃素、大黃酚4.46、7.25、13.62 μg?mL－1的混合對照品溶液。

2.2.2供試品溶液的制備取本品20丸，剪碎，取約3g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，稱定重量，加熱回流1小時，冷卻，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取5ml，置錐形瓶中，蒸干，殘渣加2.5mol/L硫酸溶液10 mL，超聲處理（功率300W，頻率50kHz）5min，再加三氯甲烷10mL，置水浴上加熱回流1h，立即冷卻，用少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取三次，每次10mL，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘渣加甲醇使溶解，轉移至10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3陰性供試品溶液的制備取缺大黃陰性樣品適量，照供試品溶液制備方法制得陰性供試品溶液。

2.3系統(tǒng)適應性試驗

按“2.1”項下色譜條件，精密吸取供試品溶液、對照品溶液及陰性樣品溶液各10 μL進樣，結果大黃酸、大黃素、大黃酚與鄰峰基線分離，理論板數(shù)按大黃素峰計不低于7000，且其他成分不干擾其測定，色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

A.混合對照品，B.樣品，C.陰性樣品，1.大黃酸，2.大黃素，3.大黃酚

2.4線性關系的考察

精密吸取“2.2.1”項下對照品混合溶液2.0、4.0、6.0、10.0、16.0、20.0μl分別注入高效液相色譜儀測定，記錄峰面積，以峰面積（A）為縱座標，以進樣量（C）為橫座標，繪制標準曲線，大黃酸回歸方程為A=3.218×104 C－2.682×103， r=0.9998（n＝6），在7.92～79.2ng呈良好的線性關系；大黃素回歸方程為A=2.878×104C－3.042×103，r=0.9991（n＝6），在14.5～145ng呈良好的線性關系；大黃酚回歸方程為A=3.588×104 C－1.042×104，r=0.9994（n＝6），在27.24～272.4ng呈良好的線性關系。

2.5精密度試驗

取對照品混合溶液在“2.1”項下色譜條件下，每次進樣10μL，重復進樣6次，大黃酸、大黃素、大黃酚峰面積的RSD值分別為1.2%、0.8%、0.6%。

2.6穩(wěn)定性試驗

取批號20120906的供試品溶液，分別于0、1、3、5、10h分別進樣測定，結果5次進樣大黃酸峰面積的RSD=1.4%；大黃素峰面積的RSD=0.9%；大黃酚峰面積的RSD=1.2%，結果表明供試品溶液在10h內穩(wěn)定。

2.7重復性試驗

取批號20120906的樣品，按“2.2.2”供試品溶液制備方法制備6份供試品溶液，依法測定，大黃酸平均含量為0.2948mg/g，RSD=0.8%；大黃素平均含量為0.4015 mg/g，RSD=1.1%；大黃酚平均含量為0.6700 mg/g，RSD=1.2%，結果表明該方法的重復性好。

2.8回收率試驗

取已知含量的樣品（批號：20120906，含大黃酸、大黃素、大黃酚分別為0.2948、0.4015、0.6700mg?g-1），剪碎，取約1.5g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入甲醇50ml，稱定重量，加熱回流1小時，冷卻，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取5mL，分別精密加入混合對照品溶液（含大黃酸、大黃素、大黃酚4.46、7.25、13.62 μg?mL－1）8.0、10.0、12.0mL各3份，按“2.2.2”項下，自“蒸干，殘渣加2.5mol/L硫酸溶液10 mL”起，制備供試品溶液，按“2.1”項下測定含量，結果見表1。

表1 回收率試驗結果

Tab 1ResultofDetermination of sample recovery (n=3)

2.9樣品的測定

取供試品溶液分別注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定，記錄峰面積，測定3批樣品，結果見表2

表2 樣品含量測定結果(n=3)

Tab 2ResultofDetermination of rhein、emodin、chrysophanol (n=3)

批號 含量(mg/g) 大黃酸 大黃素 大黃酚20120906 0.2948 0.4015 0.670020121101 0.3102 0.4528 0.732820130305 0.3148 0.4600 0.72823 討論

3.1測定波長的選擇

分別取三種對照品溶液，于200nm～600nm范圍內進行掃描，結果三種對照品均在254、285、430nm處有最大吸收，選擇254nm作為測定波長，發(fā)現(xiàn)雜質在此波長處吸收很強，干擾主成分的測定，而在430nm處雜質吸收弱，雜質干擾小，有利于樣品中有效成分的測定，故選定430nm作為檢測波長。

3.2 提取溶劑的選擇［4］

試驗曾選用三氯甲烷和乙醚對樣品進行提取，三氯甲烷提取的大黃酸、大黃素和大黃酚的含量遠遠高于乙醚，故選用三氯甲烷作為提取溶劑。提取2次和提取3次含量無明顯差別，故選擇提取2次。

3.3回流時間的的考察［5］

為保證樣品中樣品的結合蒽醌能完全水解為游離蒽醌，用2.5mol/L硫酸溶液對樣品的結合總蒽醌進行加熱水解，試驗了3個不同的水解時間，第一份加熱水解0.5h、第二份加熱水解1.0h、第三份加熱水解1.5h，按上述擬定的供試品溶液制備方法及含量測定項下的條件，依法測定。結果表明，回流提取0.5小時，樣品中的大黃素水解不完全，回流提取1.0、1.5h，均可使樣品中的大黃素水解完全，因此確定加入2.5mol/L的硫酸溶液10mL與三氯甲烷10ml回流提取時間為1.0h。

3.4 流動相的選擇

比較了甲醇與0.1%磷酸的多種不同配比，結果甲醇：0.1%磷酸=80:20，出峰時間適當，峰形好，且大黃酸、大黃素、大黃酚與鄰峰基線分離好。

參考文獻

［1］衛(wèi)生部藥品標準委員會.中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準（WS3-B-1878-15） ［S］.中藥成方制劑?第十冊.1995:8.

［2］肖燕. 上清丸質量標準的研究［J］.中國民族民間醫(yī)藥，2008，17(8):35-37.

［3］陳蓓，易愛純，王寧. 高效液相色譜法測定上清丸中鹽酸小檗堿的含量［J］.中南藥學，2008，6（6）：719-721.

［4］ 劉譯.RP-HPLC法測定牛黃至寶丸中大黃素和大黃酚的含量 ［J］.中醫(yī)藥導報，2007，13（8）：83-84.

［5］ 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典 (一部)［M］,北京:化學工業(yè)出版社.2010:17,132,145．

［6］ 谷俊峰，張俊安. HPLC法測定通降膠囊中大黃素、大黃酚和大黃酸的含量［J］.中國藥師，2004，7（9）：694-696.

［7］ 陳士虎，陳瑞云，呼延玲. HPLC測定皮膚病血毒丸中大黃素與大黃酚的含量［J］. 中國藥師，2006，9（1）：47-48.

［8］ 白麗杰，王春梅，劉君富. 肝胃氣痛片中大黃素和大黃酚含量的HPLC測定［J］.藥物分析雜志，2006，26（5）：689-691.

［9］ 張玉臣，劉學東，王永平，等. HPLC測定大黃通便顆粒中大黃素和大黃酚的含量［J］. 中成藥，2005，27（4）：478-479.

［10］ 曹緯國，劉志勤，紹赟，等. 青海省道地藥材唐古特大黃中4種蒽醌衍生物的含量測定［J］.西北植物學報，2004，24（11）：2140-2142.