羅昭遜 莫 非 楊國珍 張 姝 張 然 孫朝琴 袁 竺

貴陽醫(yī)學院醫(yī)學檢驗學院，貴州貴陽 550004

幽門螺桿菌（helicobacter pylori，Hp）是一種單極、多鞭毛、末端鈍圓的革蘭陰性螺桿菌，為胃部常見致病菌，其致病性與毒力性均很強。目前研究認為，Hp感染是慢性活動性胃炎和消化性潰瘍的主要病因，與胃癌、MALT淋巴瘤的發(fā)生密切相關。據(jù)文獻報道，全世界超過50%的人有Hp感染，Hp感染在我國分布廣泛，感染率為40%～90%，多數(shù)地區(qū)為50%左右，平均感染率為59%[1]。Hp的根除有助于潰瘍愈合，可降低胃癌發(fā)生的危險性，延緩MALT淋巴瘤的進程，因此，Hp感染的治療一直是胃腸病領域的研究焦點之一。Hp根除治療一般采用聯(lián)合用藥，即質(zhì)子泵抑制劑PPI或鉍劑，聯(lián)合應用2種抗生素。但隨著抗生素的廣泛應用和Hp根除治療的普遍開展，Hp對常用抗生素的耐藥率呈現(xiàn)逐年上升趨勢。目前治療Hp常用的抗生素包括硝基咪唑類、大環(huán)內(nèi)酯類、青霉素類、四環(huán)素類以及喹諾酮、硝基呋喃、利福霉素類，并且各地所報道的各藥物耐藥率存在較大差異。為了初步了解Hp的感染情況及對甲硝唑、阿莫西林、克拉霉素、左氧氟沙星、四環(huán)素的耐藥情況，本實驗對收集的580例胃黏膜標本進行Hp培養(yǎng)，并對Hp臨床分離株進行上述5種抗生素敏感性實驗。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株來源 Hp臨床菌株均分離自2012年1月～2013年1月貴陽醫(yī)學院附屬醫(yī)院消化科就診并經(jīng)病理診斷為胃潰瘍、胃炎患者共580例，利用胃鏡活檢鉗采集患者胃竇部黏膜，進行Hp培養(yǎng)，菌株經(jīng)尿素酶實驗、過氧化氫酶實驗和Hp快速診斷實驗進行鑒定。Hp菌株ATCC700392、ATCC700824購買于ATCC。由貴陽醫(yī)學檢驗學院實驗教學中心保存。

1.1.2 主要試劑 幽門螺桿菌快速尿素酶試紙（杭州天和微生物試劑有限公司）；甲硝唑、左氧氟沙星、克拉霉素、阿莫西林、四環(huán)素E-test試紙條（瑞典ABBiodisk公司），萬古霉素（批號為：V2002，純度 98%，規(guī)格 100mg，美國 Sigma）；兩性霉素（批號為：A9528，純度 98%，規(guī)格 100 mg，美國 Sigma）；多粘霉素（批號為：S0414，純度 98%，規(guī)格 25 mg，美國 Sigma）；TMP（批號為：T7883，純度98%，規(guī)格1 g，美國Sigma），哥倫比亞瓊脂（英國OXOID公司）；脫纖維羊血（廣州蕊特生物科技有限公司）；

1.3 方法

1.3.1 細菌分離培養(yǎng)和鑒定 取行電子胃鏡檢查患者的胃竇部胃黏膜組織標本，放入裝有預冷腦心浸液無菌離心管中，經(jīng)研磨后利用Hp快速尿素酶實驗進行篩選，陽性者接種于哥倫比亞瓊脂血平板37℃微需氧袋培養(yǎng)72～96 h后，經(jīng)革蘭染色鏡檢和過氧化氫酶實驗、氧化酶試驗、尿素酶試驗鑒定為Hp后，進行增菌及傳代培養(yǎng)[2-3]。

1.3.2 藥敏試驗 將臨床株Hp用無菌營養(yǎng)肉湯配制成109cfu/mL濃度的懸液，均勻涂布于含有10%脫脂羊血哥倫比亞血瓊脂平板，待干后貼上E-test試紙條（甲硝唑、阿莫西林、克拉霉素；左氧氟沙星、四環(huán)素），孵育2 d后觀察Hp對甲硝唑、阿莫西林、克拉霉素、左氧氟沙星和四環(huán)素的抑菌情況，抑菌環(huán)和試條交界處的刻度即為最低抑菌濃度值（MIC）。甲硝唑＞32 μg/mL；阿莫西林＞8 μg/mL；克拉霉素＞2 μg/mL；左氧氟沙星＞2 μg/mL；四環(huán)素 2 μg/mL 判定為耐藥[4-5]。

2 結(jié)果

2.1 Hp的培養(yǎng)結(jié)果

580例患者中Hp感染陽性為334例，檢出率為57.6%，其中經(jīng)分離培養(yǎng)得到的313株為無色透明，針尖樣細小，表面光滑濕潤的Hp典型的菌落形態(tài)，經(jīng)革蘭染色鏡檢呈陰性，菌體細長彎曲呈螺形，S型或海鷗型，過氧化氫酶實驗、氧化酶實驗及尿素酶實驗均為陽性，Hp培養(yǎng)陽性率為54.0%（313/580）。另外21例胃黏膜標本雖鑒定為培養(yǎng)Hp陽性，但有其他細菌污染，未能分離出Hp單個菌落，未能做藥敏實驗。

2.2 Hp對5種抗生素的藥敏結(jié)果

Hp對甲硝唑、阿莫西林、克拉霉素、左氧氟沙星、四環(huán)素的耐藥率分別為 87.2%，25.5%，8.5%，46.8%，23.4%。見表1。

表1 313株Hp對5種抗生素的耐藥情況[n（%）]

3 討論

自20世紀80年代國外學者從胃黏膜活檢組織中分離出Hp以來，大量研究證實Hp不但是人慢性活動性胃炎及胃-十二指腸潰瘍的主要致病因素，而且與MALT淋巴瘤和胃癌的發(fā)生也密切相關，1994年被國際癌癥研究機構(gòu)（IRAC/WHO）明確為Ⅰ類人胃癌致癌原。因此根除Hp是預防Hp相關性疾病的主要措施。Hp的流行情況常隨著經(jīng)濟發(fā)展狀況、居住條件、飲食衛(wèi)生等社會因素而變化，一般而言，經(jīng)濟發(fā)達的地區(qū)感染率往往低于發(fā)展中國家。本研究對580例患者胃鏡檢查胃黏膜標本進行Hp培養(yǎng)，其陽性率為54.0%，與張玲霞等[6]報道Hp培養(yǎng)陽性率（52%）相近。胃黏膜標本培養(yǎng)Hp陽性檢出率遠遠低于血清學調(diào)查的檢出率，可能是由于血清學方法因其抗體水平受到一些因素的影響，如感染后抗體水平陽性可持續(xù)較長時間，而Hp的培養(yǎng)還與標本取材部位、培養(yǎng)條件等有關。

目前臨床多采用質(zhì)子泵抑制劑（PPI）聯(lián)合2種抗生素的三聯(lián)療法為一線根除Hp方案，常用抗生素包括阿莫西林、甲硝唑和克拉霉素等，在一線治療失敗后進行補救治療中選用四環(huán)素和左氧氟沙星等藥物。隨著抗生素的廣泛應用，Hp耐藥率也在逐漸上升，并呈現(xiàn)出地區(qū)差異。

甲硝唑具有高效的殺菌作用，而且其作用不受胃酸的影響，價格便宜，因此成為治療Hp感染的首選藥物。但是由于甲硝唑的廣泛使用，其耐藥菌株日益增多，耐藥率逐年上升。2005年西安地區(qū)37株Hp對甲硝唑耐藥率為81.08%[7]。張曉光等[8]對廣州地區(qū)人群的耐藥情況研究顯示，甲硝唑的耐藥率為51.8%。本研究分離的313株Hp對甲硝唑的耐藥率高達為87.2%。當甲硝唑耐藥率達40%時，Hp的根除率會顯著下降，提示貴陽醫(yī)學院附屬醫(yī)院Hp對甲硝唑的耐藥率已達到較高水平而應引起臨床的注意。

阿莫西林是一種β-內(nèi)酰胺類藥物，阿莫西林可專一性地與細菌內(nèi)膜上的靶蛋白PBPs（青霉素結(jié)合蛋白）結(jié)合，抑制肽聚糖的合成，從而發(fā)揮殺菌作用。阿莫西林由于殺菌能力強，且與克拉霉素的聯(lián)合應用可以降低克拉霉素的耐藥性，因此阿莫西林成為根除Hp治療的良好藥物之一。本組資料顯示，貴陽醫(yī)學院附屬醫(yī)院Hp對阿莫西林的耐藥率高達25.5%，普遍高于其他地區(qū)?？死顾氐哪退幝矢鞯貓蟮啦槐M相同，北京、上海、廣東對克拉霉素耐藥率分別15.7%、10%、6.1%[9-11]。本研究克拉霉素的耐藥率為8.5%，與全國各地情況基本一致，提示貴陽醫(yī)學院附屬醫(yī)院在治療Hp感染時可選用PPsAC（PPI聯(lián)合阿莫西林和克拉霉素三聯(lián)療法）作為治療方案。

左氧氟沙星屬于喹諾酮類藥物，具有殺菌作用，通過抑制DNA旋轉(zhuǎn)酶（一種由gyrA、gyrB分別編碼A、B亞單位的四聚體，具催化DNA負性超螺旋的作用）而起作用。有研究表明左氧氟沙星有較好的抗Hp作用，耐藥率較低，且對克拉霉素和甲硝唑耐藥的Hp仍保持抗菌活性，可作為克拉霉素的替代藥物[12]。我國各地區(qū)Hp左氧氟沙星耐藥情況也有差異，北京為 29.1%[9]，上海為3.8%[10]。在本研究中有147例左氧氟沙星耐藥，耐藥率達到46.8%，高于其他地區(qū)?？赡苡捎谫F陽醫(yī)學院附屬醫(yī)院喹諾酮類藥物使用較廣泛有關。

四環(huán)素為廣譜抗生素，20世紀90年代初美國學者使用四環(huán)素、鉍劑、甲硝唑根除Hp，隨后國外有較多關于四環(huán)素對Hp根治療效的研究，并與鉍劑、PPI、甲硝唑組成的四聯(lián)療法作為二線治療方案。四環(huán)素近年來作為替代藥物用于Hp的根除治療，其耐藥情況較少見到報道，平均在5%左右[13]。本研究發(fā)現(xiàn)Hp對四環(huán)素的耐藥率為23.4%，相比其他地區(qū)較為嚴重。因此，貴陽醫(yī)學院附屬醫(yī)院在治療Hp感染前應進行抗生素敏感性實驗，做好耐藥性檢測。

通過幽門螺桿菌培養(yǎng)及對5種抗生素的藥物敏感試驗，發(fā)現(xiàn)貴陽醫(yī)學院附屬醫(yī)院幽門螺桿菌對甲硝唑、阿莫西林、左氧氟沙星、四環(huán)素的耐藥率高于全國其他地區(qū)，對克拉霉素有較好的抗菌活性，提示克拉霉素可以成為Hp補救治療的理想藥物之一。對于治療方案的選擇，應以患者情況為依據(jù)，在了解各種治療方察的利弊后加以取舍。有條件的情況下，治療前應進行抗生素敏感性試驗，避免使用Hp耐藥的抗生素[14-16]。重視幽門螺桿菌培養(yǎng)，定期進行耐藥性監(jiān)測，對臨床合理選用抗生素，提高根除率，降低復發(fā)率，減少耐藥菌株的產(chǎn)生有著十分重要的意義。

[1]胡伏蓮.幽門螺桿菌感染的流行病學[J].中國醫(yī)刊，2007，42（2）：17-18.

[2]黃衍強，趙麗娟，黃贊松，等.桂西地區(qū)幽門螺桿菌對克拉霉素的耐藥性分析[J].中華微生物學與免疫學雜志，2009，29（1）：37-39.

[3]黃衍強，趙麗娟，黃贊松，等.不同基因型的幽門螺桿菌耐藥性分析[J].廣東醫(yī)學，2010，31（18）：2378-2379.

[4]Mendonca S，Ecclissato C，Sartori MS，et al.Prevalence of Helicobacter pyloriresistance to metronidazole，clarithromycin,amoxicillin，tetracycline，and furazolidone in Brazil[J].Helicobacter，2000，5（2）：79-83.

[5]Kim JM，Kim JS，Kim N，et al.Distribution of fluoroquinolone MICs in Helicobacter pylori strains from Korean patients[J].J Antimicrob Chemother，2005，56（5）：965-967.

[6]張玲霞，宋瑛，張瀝，等.西安地區(qū)就醫(yī)人群幽門螺桿菌耐藥狀況及變化趨勢[J].現(xiàn)代消化及介入診療，2013，18（4）：252-254.

[7]喬文，胡家露.西安地區(qū)幽門螺桿菌臨床分離株耐藥性研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志，2002，12（6）：48-49.

[8]張曉光，胡品津，李瑜元，等.廣東城鄉(xiāng)病人中分離的幽門螺桿菌對常用3種抗菌藥物耐藥的調(diào)查[J].新醫(yī)學，2002，33（5）：275-277.

[9]成虹，胡伏蓮.北京地區(qū)幽門螺桿菌耐藥情況及其變化趨勢[J].中華醫(yī)學雜志，2005，85（39）：2754-2757.

[10]史彤，劉文忠，蕭樹東，等.上海地區(qū)幽門螺桿菌對抗生素耐藥率的變遷[J].中華消化雜志，2000，39（8）：576.

[11]鄭小麗，胡伏蓮，王蔚虹，等.北京地區(qū)幽門螺桿菌對克拉霉素的耐藥情況及其耐藥機制[J].中華醫(yī)學雜志，2001，81（23）：1413-1415.

[12]Kim JM，Kim JS，Kim N，et al.Comparison of primary and secondary antimicrobial minimum inhibitory concentrations for Helicobacter pylori isolated from Korean patients[J].Int J Antimicrob Agents，2006，28（1）：6-13.

[13]黃德強，羅凌玉，丁士剛，等.204例幽門螺桿菌耐藥情況的分析[J].江西醫(yī)學院學報，2008，48（1）：84-86.

[14]李玲，姜樹強，龍麗娟，等.健康人群幽門螺桿菌感染情況調(diào)查分析[J].解放軍醫(yī)藥雜志，2013，25（10）：98-99.

[15]姜小建，謝紫陽，張玲霞，等.幽門螺桿菌耐藥研究進展[J].成都醫(yī)學院學報，2013，8（2）：214-215，221.

[16]許健波，朱以軍，單小云，等.幽門螺桿菌臨床分離株的耐藥性分析[J].中華醫(yī)院感染學雜志，2013，23（10）：2507-2508.