王維杰+嚴(yán)佶祺+李宏為

摘 要 門(mén)靜脈高壓癥是肝硬化最常見(jiàn)且致命的并發(fā)癥，建立動(dòng)物模型是研究門(mén)靜脈高壓癥的理論基礎(chǔ)。本文綜述門(mén)靜脈高壓癥小動(dòng)物模型的構(gòu)建方法及各種模型的特點(diǎn)和研究進(jìn)展，以在研究中可根據(jù)不同目的選用恰當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型。

關(guān)鍵詞 門(mén)靜脈高壓癥 肝硬化 動(dòng)物模型

中圖分類(lèi)號(hào)：R657.3+4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：C 文章編號(hào)：1006-1533（2014）18-0003-05

Establishment of small animal models for portal hypertension and its research progress

WANG Weijie1，2， YAN Jiqi1， LI Hongwei1

（1.Department of Surgery， Ruijin Hospital， School of Medicine， Shanghai Jiao Tong University， Shanghai 200025， China； 2. Department of Surgery， the First Affiliated Hospital， School of Medicine， Zhengzhou University， Zhengzhou 450052， China）

ABSTRACT Portal hypertension （PHT） is the most common and fatal complication of cirrhosis. Animal model is the theoretical basis in PHT research. This paper reviews the common methods used in the establishment of PHT small animal models， as well as their characteristics and research progress. The appropriate animal models can be selected according to different purposes of study.

KEY WORDS portal hypertension； liver cirrhosis； animal model

我國(guó)是慢性肝炎和肝硬化的高發(fā)地區(qū)，約有10%的人群為乙型肝炎病毒（HBV）攜帶者，每年因肝硬化死亡的人數(shù)高達(dá)數(shù)十萬(wàn)。門(mén)靜脈高壓癥（portal hypertension， PHT）是肝硬化最常見(jiàn)且致命的并發(fā)癥[1- 2]。構(gòu)建穩(wěn)定、可重復(fù)性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單和模擬性好的動(dòng)物模型，是研究PHT入肝血流阻力增加、側(cè)支循環(huán)建立與開(kāi)放、內(nèi)臟系統(tǒng)血流高動(dòng)力循環(huán)等病理生理的重要手段[3- 4]。因此，本文綜述研究面廣、應(yīng)用性強(qiáng)的小動(dòng)物PHT模型的構(gòu)建及研究進(jìn)展。

肝前型PHT

部分門(mén)靜脈結(jié)扎（partial portal vein ligation， PPVL）模型已廣泛應(yīng)用于PHT病理生理學(xué)機(jī)制的研究[5- 6]，原理是通過(guò)縮窄門(mén)靜脈主干，使門(mén)靜脈血液回流受阻從而導(dǎo)致門(mén)靜脈壓力升高，但肝臟組織學(xué)幾乎正常[7]。通常是把1個(gè)20號(hào)鈍頭直針（直徑0.889 mm）縱向置于大鼠門(mén)靜脈主干旁，用3-0絲線(xiàn)將門(mén)靜脈和直針結(jié)扎后抽出直針，使門(mén)靜脈主干直徑僅為0.889 mm，而小鼠通常選用27號(hào)鈍頭直針和5-0的絲線(xiàn)結(jié)扎，造成門(mén)靜脈一定程度狹窄，從而建立PHT模型[8- 9]。

PPVL模型操作簡(jiǎn)單、廉價(jià)、重復(fù)性好、門(mén)靜脈高壓形成迅速且持續(xù)穩(wěn)定。通常術(shù)后2 d門(mén)靜脈側(cè)支可檢出分流，術(shù)后4 d腸系膜血管開(kāi)始明顯擴(kuò)張，心輸出量也顯著增加[4]，術(shù)后1周，大鼠PHT已完全形成，包括顯著的血流高動(dòng)力循環(huán)和門(mén)靜脈側(cè)支分流[7- 8]。之后，隨著側(cè)支循環(huán)的開(kāi)放，門(mén)靜脈壓力會(huì)有所下降，但PHT可穩(wěn)定地維持至術(shù)后3周以上[5]。該模型主要適用于門(mén)靜脈系統(tǒng)高動(dòng)力循環(huán)狀態(tài)和側(cè)支循環(huán)形成機(jī)制的研究，以及前向性學(xué)說(shuō)的探討[10-11]（表1）。

肝內(nèi)型PHT模型

膽總管結(jié)扎離斷（common bile duct ligation， CBDL）

CBDL模型是一種繼發(fā)性膽汁性肝硬化PHT [12]，原理是手術(shù)使肝外膽總管梗阻，從而引起梗阻部位以上膽管擴(kuò)張、膽汁淤積及膽道內(nèi)壓力增高，甚至可引發(fā)肝內(nèi)小膽管擴(kuò)張破裂。擴(kuò)張膽管及膽汁外滲壓迫肝內(nèi)血管，導(dǎo)致肝內(nèi)血管系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的扭曲和變形，使肝細(xì)胞缺血和壞死，纖維組織增生向膽管伸展，包繞肝小葉，增加肝內(nèi)阻力和門(mén)靜脈血流量，最終形成肝硬化PHT[13-14]。具體方法是分離膽總管，在盡量靠近肝左、右膽管匯合處和胰管入口雙道結(jié)扎膽總管，然后切除兩結(jié)扎點(diǎn)之間膽總管，以避免膽管再通[15]。

CBDL模型門(mén)靜脈壓力升高顯著，并可出現(xiàn)廣泛的門(mén)體分流。由于大鼠無(wú)膽囊，因此PHT形成相對(duì)迅速且穩(wěn)定。而小鼠耐受性差，往往因膽囊急劇擴(kuò)大，甚至穿孔而死亡率增加[4]。大鼠在CBDL術(shù)后2周即表現(xiàn)輕微的門(mén)靜脈高壓，術(shù)后3周門(mén)靜脈壓力已顯著而穩(wěn)定地升高，肝內(nèi)主要以膽管內(nèi)皮細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞增殖和炎性滲出為主[16]。而術(shù)后4～6周膽汁性肝硬化PHT可穩(wěn)定形成，表現(xiàn)為嚴(yán)重的高門(mén)靜脈壓力、血流高動(dòng)力循環(huán)和30%～60%的門(mén)體分流，通常約60%的大鼠可形成腹水[4]。而相對(duì)小鼠而言，CBDL術(shù)后2～3 d為急性肝細(xì)胞損傷的高峰期，主要表現(xiàn)為肝內(nèi)中性粒細(xì)胞大量滲出，促增殖基因上調(diào)，膽汁梗阻和血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶達(dá)高峰。術(shù)后5 d，肝細(xì)胞增殖修復(fù)反應(yīng)出現(xiàn)高峰。術(shù)后2～3 d，大膽管出現(xiàn)膽管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，而小膽管內(nèi)皮細(xì)胞增殖則出現(xiàn)于術(shù)后5 d。術(shù)后14 d肝內(nèi)主要為淋巴細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞浸潤(rùn)，表現(xiàn)為慢性炎癥和纖維化修復(fù)反應(yīng)，間質(zhì)內(nèi)累積合成大量膠原蛋白[17]。

CBDL模型與人類(lèi)肝硬化患者在門(mén)靜脈及全身血流動(dòng)力學(xué)方面有較好的相似性，適合肝硬化PHT病理生理學(xué)機(jī)制的研究，也是探索藥物治療作用的有效模型[18-20]，但是存在以下缺陷：①存留的膽總管易形成膽管囊腫，壓迫門(mén)靜脈主干，而結(jié)扎前膽管內(nèi)注射4%的甲醛溶液可解決此問(wèn)題；②術(shù)后5周死亡率高達(dá)20%，但是術(shù)前預(yù)防性給予抗生素（青霉素100 mg/kg）和術(shù)后每周1次注射維生素K（50 μg）可有效降低死亡率；③不適合膽汁代謝藥物的研究；④術(shù)后腹腔黏連，不利于下一步外科手術(shù)操作，膽管解剖變異導(dǎo)致建模失敗[4]。

四氯化碳（carbon tetrachloride， CCl4）誘導(dǎo)肝硬化PHT模型

CCl4是肝硬化誘導(dǎo)最常用的化學(xué)物質(zhì)，具有量效關(guān)系，其作用原理是CCl4進(jìn)入機(jī)體后，經(jīng)肝細(xì)胞微粒體細(xì)胞色素P450激活生成活性三氯甲基（CCl3），CCl3再通過(guò)攻擊肝細(xì)胞膜的磷脂引起脂質(zhì)過(guò)氧化從而破壞膜性結(jié)構(gòu)，并可與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合，損害線(xiàn)粒體導(dǎo)致肝內(nèi)還原性輔酶A（NADH）和三磷酸腺苷（ATP）生成減少，進(jìn)而抑制脂肪酸氧化和三羧酸循環(huán)，導(dǎo)致小葉中央肝細(xì)胞壞死。此外，由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)受損可導(dǎo)致脂蛋白合成障礙，使三酰甘油和脂肪酸在肝細(xì)胞內(nèi)蓄積，形成脂肪變性。病變部位募集的巨噬細(xì)胞和各種炎性細(xì)胞清除壞死區(qū)域，并激活纖維化修復(fù)反應(yīng)，增加細(xì)胞外間質(zhì)合成，最終由增生的實(shí)質(zhì)和間葉細(xì)胞取代壞死的肝細(xì)胞團(tuán)。因此，低濃度的CCl4反復(fù)應(yīng)用，可使肝組織受到損害-修復(fù)-損害的循環(huán)破壞作用，最終導(dǎo)致肝硬化PHT [3， 14]。

CCl4誘導(dǎo)的有效途徑包括腹腔注射、口服灌胃和霧化吸入，通常多采用30%～60%CCl4橄欖油劑，造模時(shí)間依給藥途徑和劑量而不同。對(duì)于傳統(tǒng)皮下注射法，CCl4易被機(jī)體吸收進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，對(duì)腦、腎毒性較大，注射位置易發(fā)生浸潤(rùn)性膿腫和潰瘍，死亡率高達(dá)30%～40%，且肝硬化形成率較低，因此不推薦此方式[4]。CCl4腹腔內(nèi)注射時(shí)，經(jīng)門(mén)靜脈系統(tǒng)吸收的濃度高，肝硬化形成時(shí)間短，但死亡率為20%～35%。CC14 灌胃的吸收和代謝途徑類(lèi)似于腹腔注射，經(jīng)門(mén)靜脈系統(tǒng)進(jìn)入肝實(shí)質(zhì)，但操作相對(duì)復(fù)雜，腸道反應(yīng)較大。用中小劑量（1.6 g/kg）CCl4制備小鼠肝硬化時(shí)，灌胃誘導(dǎo)的速度優(yōu)于腹腔注射，且兩者生存率無(wú)差異[21]。CC14霧化吸入時(shí)，2～4周即可見(jiàn)顯著的纖維化，5～7周后可見(jiàn)嚴(yán)重的纖維間隔形成，8～9周后即可形成肝硬化，但該法對(duì)呼吸道刺激大，動(dòng)物不易耐受，中樞毒性較大，易污染環(huán)境和傷害實(shí)驗(yàn)人員[22]。

此外，CC14 與苯巴比妥聯(lián)合誘導(dǎo)的方法也很常用，其機(jī)制為苯巴比妥誘導(dǎo)肝內(nèi)混合功能氧化酶，增加細(xì)胞色素P450活性，加速CCl4向CC13轉(zhuǎn)化。在CCl4給藥前1周，大鼠飲用水中加入苯巴比妥（300 mg/L），12～15周后即可形成小結(jié)節(jié)性肝硬化，呈現(xiàn)典型PHT、30%～60%的門(mén)體分流和血流高動(dòng)力循環(huán)，且多數(shù)大鼠在12～20周可形成腹水。這種方法可明顯縮短建模時(shí)間，8～10周便可形成肝硬化，但由于大鼠的敏感性不同，實(shí)驗(yàn)中很難保證同一批模型的均質(zhì)性，且死亡率可增至40%，而根據(jù)動(dòng)物體重變化及耐受情況調(diào)整CCl4劑量，能有效地降低大鼠死亡率[4]。

總之，CC14模型在形態(tài)學(xué)、病理生理學(xué)的某些方面與人類(lèi)肝硬化類(lèi)似，兩者均有肝細(xì)胞壞死后的再生，晚期的纖維浸潤(rùn)幾乎不可逆，適于肝硬化PHT腹水和側(cè)支循環(huán)形成機(jī)制的研究[23- 24]。

硫代乙酰胺（thioacetamide， TAA）和二甲基亞硝胺（dimethylnitrosamine， DMNA）誘導(dǎo)肝硬化PHT模型

長(zhǎng)期低劑量應(yīng)用某些致癌物如TAA和DMNA等可誘導(dǎo)動(dòng)物肝硬化PHT和肝癌的發(fā)生[14]。TAA是一種選擇性肝細(xì)胞毒素，能夠穩(wěn)定地誘導(dǎo)化學(xué)毒性肝硬化和膽管癌模型。TAA進(jìn)入機(jī)體后首先由肝細(xì)胞微粒體單加氧酶、還原型輔酶Ⅱ（NADPH）及細(xì)胞色素P450作用下轉(zhuǎn)化成乙酰胺及TAA-S-oxide，后者進(jìn)而轉(zhuǎn)化為兩種不穩(wěn)定的活性代謝物產(chǎn)物TAA-S和S-dioxide，它們通過(guò)共價(jià)結(jié)合大分子導(dǎo)致肝細(xì)胞變性、壞死。通常TAA首先作用于靜脈周?chē)蛥R管區(qū)，短期的大劑量應(yīng)用可導(dǎo)致肝小葉中心急性壞死。長(zhǎng)期慢性作用可促使膽管增生和肝硬化發(fā)生，且在組織學(xué)上與病毒誘發(fā)的肝硬化很相似。反復(fù)應(yīng)用TAA，激活肝內(nèi)纖維化修復(fù)和炎性反應(yīng)，最終誘發(fā)肝硬化PHT [3， 14]。

TAA主要以大結(jié)節(jié)性肝硬化為主，通常采取口服TAA飲用水和腹腔注射途徑，且后者更穩(wěn)定。通常在12周時(shí)出現(xiàn)PHT，典型的血流高動(dòng)力循環(huán)出現(xiàn)在12周之后，約40%的大鼠可形成腹水，而18周后多可形成膽管癌。不同于CCl4，TAA誘導(dǎo)的肝硬化狀態(tài)穩(wěn)定，停藥短期不表現(xiàn)自然恢復(fù)效應(yīng)[3-4]。

DMNA是另一種具有肝毒性、細(xì)胞毒性和免疫毒性的化學(xué)物質(zhì)，主要在肝微粒體藥物氧化酶系統(tǒng)進(jìn)行氧化代謝，活性代謝產(chǎn)物可導(dǎo)致體內(nèi)核苷酸、氨基酸殘基等重要的生命物質(zhì)發(fā)生甲基化，從而促進(jìn)肝細(xì)胞壞死，細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行性增加，最終誘發(fā)肝纖維化和肝硬化發(fā)生。DMNA通常以腹腔注射途徑給藥，在連續(xù)給藥5周后大鼠可出現(xiàn)肝纖維化和門(mén)靜脈高壓，但形成典型的肝硬化和腹水多需誘導(dǎo)13周以上[4]。

PHT模型的選擇（表2）

肝內(nèi)阻力不斷增加和內(nèi)臟血流高動(dòng)力循環(huán)是肝硬化PHT形成的主要病理生理機(jī)制，而肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞功能異常和組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行性紊亂是肝內(nèi)阻力增加的主導(dǎo)因素[1]。在肝硬化PHT肝內(nèi)血管緊張性增加和血管反應(yīng)性失衡等機(jī)制的研究中，CCl4模型應(yīng)用最多，研究證實(shí)肝血竇內(nèi)皮功能紊亂導(dǎo)致NO產(chǎn)生不足和血管收縮性物質(zhì)合成增加是肝內(nèi)血管反應(yīng)性異常的主要原因。此外，CBDL和TAA模型也可用于肝內(nèi)血管反應(yīng)性異常的研究，但不如CCl4模型穩(wěn)定一致[4]。

內(nèi)臟小動(dòng)脈血管舒張是血流高動(dòng)力循環(huán)演進(jìn)中典型的病理生理特征，其原因是肝外NO為主的舒血管物質(zhì)合成增加和內(nèi)臟小血管對(duì)內(nèi)源性收縮物質(zhì)的高反應(yīng)性[23]。PPVL、CBDL、CCl4和TAA/DMNA模型均可用于血流高動(dòng)力和側(cè)支循環(huán)形成病理機(jī)制的研究。與肝內(nèi)型PHT相比，PPVL模型制備穩(wěn)定、便捷，且肝外分流近100%，而前者一般不會(huì)超過(guò)60%。因此，對(duì)于PHT系統(tǒng)、腸系膜和側(cè)支循環(huán)異常的研究，PPVL模型的有效性展現(xiàn)了更大的優(yōu)勢(shì)，非常適于理論假設(shè)的初步探索，而后期采用肝硬化PHT模型進(jìn)一步的驗(yàn)證也很有必要[4]。

傳統(tǒng)觀(guān)念認(rèn)為PHT腸系膜原有血管通道的再通增加了腸系膜血流循環(huán)，而新近研究表明腸系膜血管新生在內(nèi)臟血流高動(dòng)力和側(cè)支循環(huán)形成中同樣有著至關(guān)重要的作用，PPVL、CBDL和CCl4模型多見(jiàn)于此方向的研究[6， 19， 23]。此外，有關(guān)肝硬化腹水產(chǎn)生病理機(jī)制的研究，CCl4模型應(yīng)用最多，也有少數(shù)學(xué)者采用CBDL模型[4]。

綜上所述，動(dòng)物模型是實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)，不同類(lèi)型的PHT形成的主要病理機(jī)制大相徑庭，因此，穩(wěn)定地建立多種PHT動(dòng)物模型，有針對(duì)性的選擇適合研究方向的模型，更有利于揭示PHT演進(jìn)中確切的病理機(jī)制，為其靶向治療提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（收稿日期：2014-07-05）