謝鳳珍,華承偉,牛宏陽

（河南科技學院,河南新鄉(xiāng)453003）

木聚糖是自然界中含量僅次于纖維素的第二大類多糖,是半纖維素中含量最豐富的一種,占地球可再生有機碳的三分之一[1].木聚糖主鏈是由多個β-D-吡喃木糖基通過β-1,4-糖苷鍵連接的復雜分子多聚糖,它的存在使谷物中的營養(yǎng)物質不能被充分暴露于動物消化液的表面,進而影響動物的消化吸收,降低了飼料的營養(yǎng)價值[2-3].木聚糖酶（xylanase,EC3.2.1.8）主要以內切方式作用于木聚糖主鏈上的β-1,4-糖苷鍵,水解生成以木二糖為主的低聚糖[4],它在生物轉化、食品、飼料、醫(yī)藥、能源、造紙、紡織等行業(yè)中有著廣泛的應用[5-7].耐熱木聚糖酶菌株的篩選是木聚糖酶研究的一個熱點,對該酶的開發(fā)與研究在解決工業(yè)用酶制劑容易熱失活、保存穩(wěn)定性差的缺陷方面具有重要的意義[8].本試驗對篩選得到的耐熱產(chǎn)木聚糖酶菌株Bacillus megaterium FLH-2的酶學性質進行了初步探究.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品來源 河南新鄉(xiāng)周邊土壤、太行山南麓叢林土壤及腐殖質.

1.1.2 培養(yǎng)基

篩選及分離培養(yǎng)基/（g/L）：NH4Cl 1.0,（NH4）2SO41.0,K2HPO40.1,CaCl20.4,MgSO4·7H2O 0.1,玉米芯木聚糖1.0,瓊脂粉15,NaOH調pH至7.2.

發(fā)酵培養(yǎng)基/（g/L）：蛋白胨10,酵母粉10,玉米芯（過60目篩）20,K2HPO41.0,MgSO4·7H2O 0.3,CaCl20.4,FeSO4·7H2O 0.1.

1.1.3 試劑 酵母提取物、胰蛋白胨（Oxoid公司）,櫸木木聚糖（Sigma公司）,玉米芯木聚糖（自制）,其他試劑均為分析純.

1.1.4 主要儀器 BIOLOG自動微生物鑒定系統(tǒng)（美國Biolog有限公司）,722型分光光度計（上海青華科技儀器有限公司）.

1.2 試驗方法

1.2.1 產(chǎn)酶菌株分離 分別取土樣及腐殖質1 g左右,加入裝有10 mL滅菌的質量分數(shù)為0.9%的NaCl溶液的小三角瓶中,室溫振蕩30 min,取0.1 mL涂布篩選平板,倒置,于50℃培養(yǎng)2～3 d.用滅菌牙簽挑取單菌落,轉接于分離培養(yǎng)基進行單菌落分離.

1.2.2 產(chǎn)酶菌株復篩 用接種針挑取單菌落,接種于發(fā)酵培養(yǎng)基,200 r/min,50℃培養(yǎng)2 d.取發(fā)酵液1 mL,10 000 r/min離心5 min,取上清,按“1.2.3”的方法測定酶活,取酶活最高的菌株進行菌種鑒定.

1.2.3 酶活測定 取1.0 mL櫸木木聚糖溶液與經(jīng)適當稀釋的酶液0.1 mL混合,反應10 min后,沸水煮沸10 min中止反應,以木糖等作標準,酶活力通過DNS測定還原糖法進行[9].酶活力的單位定義為：50℃,pH 6.0的磷酸緩沖液（50 mmol/L）及櫸木木聚糖溶液質量濃度為1 g/L的條件下,每min生成1 μmol還原糖所需要的酶量.

1.2.4 菌種初步鑒定 采用美國Biolog公司GenⅢ生化鑒定板進行鑒定：經(jīng)33℃平板培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)的菌種,于超凈工作臺中用棉簽點取純種的單個菌落至接種液IF3中,制備透光率在90%～95%的菌懸液,用8道移液器,按每孔100 μL的量加到GenⅢ板的所有微孔中,置于33℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔4 h觀察微孔板中的顏色變化,待其顏色變化較明顯時用Biolog自動微生物鑒定系統(tǒng)對結果進行掃描分析,并與Biolog數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)相比較.

1.2.5 粗酶的制備 在預試驗的基礎上,發(fā)酵液經(jīng)質量分數(shù)分別為40%和60%的硫酸銨分段鹽析,沉淀重溶于蒸餾水,經(jīng)過夜透析后,10 000 r/min冷凍離心10 min,取上清,即為粗酶樣品.

1.2.6 最適pH與最適溫度測定 分別測定粗酶液在pH 2.5～11.0的4種不同緩沖液（50 mmol/L,檸檬酸緩沖液pH 2.5～5.5,MES緩沖液pH 5.0～7.0,磷酸緩沖液pH 6.0～8.5,甘氨酸-NaOH緩沖液pH 8.5～11.0）中的酶活,以最高酶活作為100%；分別于30～90℃測定酶活,以最高酶活作為100%.結果為3次重復的平均值.

1.2.7 pH和溫度穩(wěn)定性測定 取適量的酶樣品分別于1.5 mL離心管中與不同pH值的緩沖液混勻,水浴鍋中25℃保溫30 min,立即置于4℃水浴中復性20 min；另取適量酶樣品于1.5 mL離心管中于不同溫度下保溫30 min,立即置于4℃水浴中復性20 min.酶樣品經(jīng)適當稀釋后按“1.2.3”的方法測定酶活,以最高酶活作為100%.結果為3次重復的平均值.

2 結果與分析

2.1 產(chǎn)酶菌株的篩選與鑒定

經(jīng)含單一碳源的木聚糖篩選平板和50℃篩選,共篩選得到產(chǎn)木聚糖酶真菌菌株12株,經(jīng)搖瓶發(fā)酵復篩,發(fā)現(xiàn)1株細菌產(chǎn)酶活較高,可達624 U/mL,暫命名為XynB2.該菌株在40～55℃范圍內生長良好,最適生長溫度50℃左右.菌落圓形,表面粗糙不透明,污白色（見圖1）.經(jīng)Biolog自動微生物鑒定系統(tǒng)對GenⅢ生化鑒定板培養(yǎng)生化結果進行掃描分析,掃描結果與Biolog數(shù)據(jù)庫中的巨大芽孢桿菌Bacillus megaterium相似度達98%,初步命名該菌為B.megaterium FLH-2.

圖1 菌株XynB2菌落Fig.1 Colony morphologof XynB2

2.2 酶性質分析

2.2.1 木聚糖酶最適pH和pH穩(wěn)定性 木聚糖酶最適pH和pH穩(wěn)定性測定結果見圖2.

圖2 木聚糖酶最適pH和pH穩(wěn)定性Fig.2 The optimal and stability pH of xylanase from Bacillus megaterium FLH-2

由圖2可知,該芽孢桿菌所產(chǎn)木聚糖酶最適pH約為6.0（圖2（a））,在pH 5.0～7.0之間,相對酶活可達最高酶活的80%以上.在pH 5.0～9.0之間,處理30 min,相對酶活仍可保持80%以上（圖2（b））,說明該酶具有較寬范圍的pH穩(wěn)定性.

2.2.2 木聚糖酶最適溫度和溫度穩(wěn)定性 木聚糖酶最適溫度和溫度穩(wěn)定性測定結果見圖3.

圖3 木聚糖酶最適溫度和溫度穩(wěn)定性Fig.3 The optimal and stability thermoof xylanase from Bacillus megaterium FLH-2

由圖3可知,該芽孢桿菌所產(chǎn)木聚糖酶最適作用溫度約為65℃（圖3（a））,高于80℃,酶活顯著降低.在30～75℃之間,相對酶活可達最高酶活的80%以上（圖3（b））,表明該木聚糖酶有較寬的溫度作用范圍和良好的耐熱性.

3 結論

從新鄉(xiāng)周圍土樣及腐殖質篩選得到1株產(chǎn)耐熱木聚糖酶的巨大芽孢桿菌B.megaterium FLH-2,其最適生長溫度50℃,在40～55℃之間,生長良好.巨大芽孢桿菌生長溫度一般在3～45℃,最適溫度為30℃,只有極少數(shù)可在63℃生存[10-11],這就為耐熱酶的產(chǎn)生提供了條件.

該菌株所產(chǎn)木聚糖酶最適pH和溫度分別為6.0和65℃,在pH 5.0～9.0之間、溫度低于75℃條件下,相對酶活可達最高酶活的80%以上.目前報道的該菌所產(chǎn)木聚糖酶一般為耐堿性酶[12],而本研究中該菌所產(chǎn)木聚糖酶同時具有良好的耐酸性,表明該木聚糖酶可很好地應用于食品及飼料工業(yè)中.

[1]Obel N,Neumetzler L,Pauly M.Hemicelluloses and Cell Expansion[J].PlantCell Monographs,2007,5（6）：57-88.

[2]Collins T,Gerday C,Feller G.Xylanases,xylanase families and extremophilic xylanases[J].FEMS Microbiology Review s,2005,29（1）：3-23.

[3]賀丹艷,羅永發(fā).木聚糖酶生產(chǎn)工藝研究進展及性能優(yōu)化[J].飼料工業(yè),2011,32（4）：15-20.

[4]Sunna A,Antranikian G.Xylanolytic enzymes from fungi and bacteria[J].Critical Review sin Biotechnology,1997,17（1）：39-67.

[5]張世敏,劉寅,劉新育,等.木聚糖酶基因研究進展[J].微生物學雜志,2006,26（4）：61-67.

[6]Anthony T,Rajk C,Rajendran A,et al.High molecular w e ight cellulase-free xylanase from alkali-tolerant Aspergillus fumigatus AR1[J].Enzyme and Microbial Technology,2003,32（6）：647-654.

[7]Dhiman S S,Sharma J,Battan B.Pretreatmentprocessingof fabrics by alkalothermophilic xylanase from Bacillus stearothermophilus SDX[J].Enzyme and Microbial Technology,2008,43（3）：262-269.

[8]譚權,張克英.木聚糖的抗營養(yǎng)作用[J].中國家禽,2008,30（12）：55-57.

[9]Laemm li U K.Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4[J].Nature,1970,277（5259）：680-685.

[10]Vary P S,Biedendieck R,Fuerch T,et al.Bacillus megaterium from simple soil bacterium to industrial protein production host[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2007,76（5）：957-967.

[11]Vos P,Garrity G,Jones D,et al.Bergey's Manual ofSystematic Bacteriology：Volume 3：The Firmicutes[M].Springer,2009.

[12]Sindhu I,Chhibber S,Capalash N,et al.Production of cellulase-free xylanase from Bacillus megaterium by solid state fermentation for biobleachingofpulp[J].CurrentMicrobiology,2006,53（2）：167-172.