黃振娥，于 貞

（1. 煙臺(tái)欣和味達(dá)美食品有限公司，山東 煙臺(tái)264000；2. 煙臺(tái)大學(xué)，山東 煙臺(tái)264005）

貝是一種世界性分布的沿岸底棲雙殼類海洋動(dòng)物，由于其分布廣、活動(dòng)性低、商業(yè)價(jià)值高、對(duì)污染物有較強(qiáng)的生物累積能力而備受關(guān)注，很多國(guó)家把貽貝和牡蠣等貝類作為海洋污染的指示生物，廣泛應(yīng)用于海洋污染的生物監(jiān)測(cè)[1]。堿性磷酸酶（ALP）廣泛存在于自然界中，它催化磷酸單脂的水解以及磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移反應(yīng)，在生物體內(nèi)的磷代謝過程中起著十分重要的作用。海洋環(huán)境被污染，導(dǎo)致酶的構(gòu)象和活力發(fā)生改變，使得堿性磷酸酶成為生物響應(yīng)逆境環(huán)境的重要標(biāo)志之一，可以作為監(jiān)測(cè)環(huán)境脅迫的生物指標(biāo)[2-6]。本研究對(duì)紫貽貝中堿性磷酸酶進(jìn)行提取制備，測(cè)定其活力，并研究溫度、pH 值對(duì)其活性的影響及其酶促動(dòng)力學(xué)特性，為貽貝及其生化指標(biāo)作為污染指示生物的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用紫貽貝購(gòu)于煙臺(tái)大學(xué)水產(chǎn)品市場(chǎng)，將其清洗干凈，冷凍備用。供試試劑有：硝基苯磷酸二鈉（分析純）、硫酸銨（分析純）、三羥甲基氨基甲烷（實(shí)驗(yàn)室技術(shù)級(jí)）、牛血清蛋白（特級(jí)純）、鹽酸（分析純）、考馬斯亮藍(lán)G-250（分析純）。供試儀器有：721 可見光分光光度計(jì)（上海菁華科技儀器有限公司）、數(shù)控超級(jí)恒溫槽（寧波天恒儀器廠）、HR2860 飛利浦?jǐn)嚢铏C(jī)（珠海經(jīng)濟(jì)特區(qū)飛利浦家庭電器有限公司）、pH 計(jì)（梅特勒-托利多儀器有限公司）、GT10-2 高速臺(tái)式離心機(jī)（北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司）、磁力攪拌器（深圳天南海北實(shí)業(yè)有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酶的提取與測(cè)定 紫貽貝去殼，稱重，按質(zhì)量體積比1︰1.5（W︰V）分別加入預(yù)先冷卻的0.01 mol/L Tris·HCl 緩沖液（pH 值5.5、6.5、7.5、8.5、9.0、9.5、10.0），勻漿，10 000 r/min 離心后，上清液加入磨細(xì)的硫酸銨粉末，至硫酸銨飽和度分別為40%，4℃靜置沉淀4 h 以上，4 000 r/min 離心30 min，得到酶的粗提物。粗提物用0.01 mol/L Tris·HCl 緩沖液（pH 值與提取液相同）溶解，待測(cè)。采用磷酸苯二鈉法[4]測(cè)定酶活，酶液在堿性條件下反應(yīng)后，在405 nm 下測(cè)其OD 值。采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量[7]。酶的比活力（U/mg）＝酶活力（U/mL）÷蛋白質(zhì)含量（mg/mL）。

1.2.2 堿性磷酸酶性質(zhì)的研究（1）酶反應(yīng)最適pH 值的確定。測(cè)定不同pH 值下的酶活力，以酶的比活力對(duì)相應(yīng)的pH 值作圖，求出堿性磷酸酶在此反應(yīng)條件下的最適pH 值。（2）酶反應(yīng)最適溫度的確定。調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH 值為9.0，在不同溫度下測(cè)定酶活力，以酶活力對(duì)相應(yīng)的溫度作圖，確定酶作用最適溫度。（3）pH 值對(duì)酶反應(yīng)穩(wěn)定性的影響。用0.1 mol/L 不同pH 值的緩沖液配制0.1%的酶液，在4℃下靜置處理30 min，然后調(diào)酶液pH 值為9.0，在37℃下測(cè)定酶活。以處理前的最初酶活力為100%，處理30 min 后的酶活力與其比值即為相對(duì)活力。（4）溫度對(duì)酶反應(yīng)穩(wěn)定性的影響。酶液在不同溫度下（30、40、50、60℃）保溫0、15、30、45 和60 min 后，按常規(guī)方法測(cè)定酶活力，以處理前的最初酶活力為100%，保溫（t）min 后的酶活力與其比值即為相對(duì)活力。以相對(duì)活力對(duì)時(shí)間t 作圖，繪出溫度穩(wěn)定性曲線。（5）堿性磷酸酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的確定。試驗(yàn)以對(duì)硝基苯磷酸二鈉為底物，在pH 值9.0、溫度37℃的條件下反應(yīng)10 min，在405 nm處測(cè)定酶活，用L-B 作圖法求Km和Vmax。

2 結(jié)果與討論

2.1 堿性磷酸酶最適pH 值的確定

由圖1 可知，在pH 值5.5～9.0 范圍內(nèi)，隨著pH 值增大，酶的比活力緩慢上升，當(dāng)pH 值為9.0 時(shí)，酶活力達(dá)到最大值；當(dāng)pH 值高于9.0 時(shí)，酶的比活力急劇下降。因此，確定紫貽貝中堿性磷酸酶的最適pH 值為9.0。

圖1 pH 值對(duì)堿性磷酸酶活力的影響

2.2 堿性磷酸酶的最適作用溫度

由圖2 可知，在30～37℃范圍內(nèi)，隨著溫度的提高，酶的比活力逐漸上升；在37℃時(shí)，酶的比活力達(dá)到最大值；高于此溫度，酶的比活力迅速下降。因此，確定紫貽貝中堿性磷酸酶的最適作用溫度為37℃。

圖2 溫度對(duì)堿性磷酸酶活力的影響

2.3 pH 值對(duì)堿性磷酸酶穩(wěn)定性的影響

由圖3 可知，堿性磷酸酶在酸性條件下不穩(wěn)定，pH值為5.5 時(shí)，處理30 min 后，堿性磷酸酶活力喪失80%；隨著pH 值的升高，堿性磷酸酶的穩(wěn)定性逐漸增大；pH值在8.5～9.5 的范圍內(nèi)，堿性磷酸酶活力比較穩(wěn)定；當(dāng)pH 值大于9.5 后，堿性磷酸酶的穩(wěn)定性又有所下降。

圖3 pH 值對(duì)堿性磷酸酶穩(wěn)定性的影響

2.4 溫度對(duì)堿性磷酸酶穩(wěn)定性的影響

由圖4 可知，堿性磷酸酶在30～40℃時(shí)比較穩(wěn)定，隨保溫時(shí)間的延長(zhǎng)，酶相對(duì)活力的下降不明顯；在50～60℃時(shí)，酶的熱穩(wěn)定性逐漸降低，隨保溫時(shí)間的延長(zhǎng)，酶的相對(duì)活力呈下降趨勢(shì)，且溫度越高，酶穩(wěn)定性越差，酶相對(duì)活力的下降趨勢(shì)越明顯，在60℃加熱60 min后其酶活仍保留了47.5%。這說明該酶對(duì)熱具有一定的耐受力。

圖4 溫度對(duì)堿性磷酸酶穩(wěn)定性的影響

2.5 堿性磷酸酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的確定

反應(yīng)開始時(shí)對(duì)硝基苯磷酸二鈉濃度分別為2、3、4、5、8、10 mmol/L，反應(yīng)10 min 后，測(cè)定405 nm 吸光度，用L-B 作圖法求米氏常數(shù)和最大反應(yīng)速率，由圖5 計(jì)算出堿性磷酸酶的米氏常數(shù)Km=0.09 mmol/L，rmax=0.22 mmol/(L·min)。

圖5 L-B 作圖法求堿性磷酸酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

3 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，堿性磷酸酶的最適作用pH 值為9.0，最適作用溫度為37℃；堿性磷酸酶在pH 值5.5～7.5 的偏酸性范圍內(nèi)不穩(wěn)定，而在pH 值8.5～9.5 的偏堿性范圍內(nèi)較穩(wěn)定；堿性磷酸酶的穩(wěn)定性隨溫度的增加而減弱，在60℃加熱60 min 后其酶活仍保留47.5%，說明該酶對(duì)熱具有一定的耐受力；37℃時(shí)堿性磷酸酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)為：Km=0.09 mmol/L，rmax=0.22 mmol/（L·min）。

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