張 俐，安國堯，陳 凱，李長征，張文光

0 引 言

脊髓缺血再灌注損傷可致神經(jīng)功能障礙甚至癱瘓，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢［1－2］，目前仍為世界難題［3－4］。已有的模型制作方法有夾閉法、血流阻斷法、栓塞法等［5］，但使用最多的仍然是夾閉腹主動脈法。Zivin［6］采用分離腹主動脈至腎動脈水平，于左腎動脈根部上方用Scoville-Lewis動脈夾夾閉腹主動脈，暫時關閉腹腔造成脊髓缺血，阻斷血流60min后打開腹腔，松開動脈夾恢復血流，制成傳統(tǒng)脊髓缺血再灌注損傷模型。Herlambang等［7］采用腎動脈和主動脈之間夾閉腹主動脈，Kim等［8］采用夾閉腹主動脈及其分支制作 SCI鼠模型，Wang等［9］、管玉龍等［10］采用夾閉胸主動脈制成脊髓缺血再灌注損傷模型，但前期的研究發(fā)現(xiàn)，夾閉胸、腹主動脈會導致夾閉部位以下的組織缺血，如脊髓、腸、腎等組織缺血后，會產(chǎn)生炎性因子，這些炎性因子進入脊髓組織后會在原有損傷的基礎上再次加重脊髓的損傷［11－12］。所以，尋求穩(wěn)定性好、重復性高、操作性強，既能造成相應節(jié)段脊髓組織缺血，又對夾閉部位以下?lián)p傷較小、并發(fā)癥少的動物模型極其重要。本實驗通過夾閉腹主動脈和腰動脈2種方法制作脊髓缺血再灌注損傷模型，應用數(shù)字減影技術(shù)鑒定，對比分析，確定最符合臨床脊髓缺血再灌注損傷的動物模型。

1 材料與方法

1.1 材料 新西蘭家兔12只(動物合格證號:2007001100989)，雌雄不限，3月齡，體重(2.0±0.2)kg，上海生旺實驗動物養(yǎng)殖有限公司提供，許可證號:SCXK(滬)2007－0011，飼養(yǎng)環(huán)境及飲食均符合動物飼養(yǎng)標準，實驗動物處置符合倫理學標準。

1.2 主要儀器與試劑 SIEMENS數(shù)字減影儀(型號:SIEMENS MULTISTER-TOP)、倒置生物顯微鏡(Olympus BX51，Japan)、義齒基托樹脂Ⅱ型(自凝牙托粉)(A)、義齒基托樹脂液Ⅱ型(自凝牙托水)(B)、鄰苯二甲酸二乙酯(C)、油畫染料(D)、硫化鈉、鹽酸、氯胺酮、速眠新、造影劑等。

1.3 實驗方法

1.3.1 家兔血管鑄型標本的制作 按 A∶B∶C=4∶5∶2的比例配制鑄型劑。硫化鈉8 g加入100 mL的水配制成脫毛劑。造影劑與等滲鹽水等量稀釋。

家兔2只禁食稱重，從胸骨角至腹部脫毛，沖洗，并用75%乙醇擦洗 3次。按氯胺酮 0.8 mL/kg［13］、速眠新 0.2mL/kg［14］行肌內(nèi)注射麻醉。麻醉成功后，消毒，沿前正中線打開胸腔，充分暴露心臟及升主動脈，在心臟與升主動脈之間剪斷，用等滲鹽水沖洗至術(shù)野清晰為止。用4.0手術(shù)線將帶有橡膠管的玻璃套管固定在血管斷口內(nèi)，然后沿玻璃套管注入鑄型劑。待試劑凝固后，將家兔腹部皮膚稍稍劃開，放入鹽酸池中腐蝕。腐蝕完畢，按照楊成杰等［15］介紹的標本制作技術(shù)，制作標本，觀察、分析家兔的血管分布并拍照。

1.3.2 建立家兔脊髓缺血再灌注損傷模型 方法同前，家兔10只稱重后按隨機數(shù)表法分為夾閉腰動脈組、夾閉腹主動脈組。麻醉，仰臥，沿劍突至恥骨聯(lián)合處脫毛，常規(guī)消毒，在劍突至恥骨聯(lián)合偏左側(cè)處，逐層切開，夾閉腰動脈組家兔鈍性分離并充分暴露腹主動脈，找出左腎動脈，于左腎動脈下端分離出L3－6，用Scoville-Lewis動脈夾夾閉腰動脈，造成脊髓相應節(jié)段缺血，暫時關閉腹腔造成脊髓相應節(jié)段缺血，并在切口處覆蓋等滲鹽水紗布，30 min后打開腹腔，松開動脈夾使血流恢復，制成脊髓缺血再灌注損傷模型;夾閉腹主動脈組家兔鈍性分離并充分暴露腹主動脈，于右腎動脈上方夾閉腹主動脈，同上，制成脊髓缺血再灌注損傷模型。

1.3.3 數(shù)字減影技術(shù)鑒定脊髓缺血再灌注模型

模型制作好后采用數(shù)字減影血管造影技術(shù)鑒定該模型。沿腹主動脈給家兔血管中灌注造影劑后，用數(shù)字減影心血管機拍攝在夾閉期間未注入造影劑、夾閉期間注入造影劑、動脈再灌注時3個時間段脊髓血供的影像，并進行對比分析。確定脊髓缺血完全，并鏡下攝像，以鑒定模型成立。保持通風，室溫22℃。

1.3.4 HE染色鑒定2種模型脊髓組織中神經(jīng)元細胞的損傷情況 將鑒定成功的2種脊髓缺血再灌注損傷模型的家兔脊髓組織取出浸泡在4%多聚甲醛之中，24 h后對其進行脫水、石蠟包埋，將包埋好的蠟塊置入切片機，調(diào)節(jié)切片厚度為6 μm，切取蠟帶，挑選組織形態(tài)完整的蠟帶貼于防脫玻片上，放入60℃恒溫箱烤片1 h，室溫下冷卻5 min，按照以下步驟脫蠟復水:二甲苯Ⅰ15 min、二甲苯Ⅱ15 min、100%乙醇Ⅰ10 min、100%乙醇Ⅱ10 min、90%乙醇10 min、70% 乙醇 10 min、50% 乙醇 10 min、雙蒸水5 min，接著將玻片浸入蘇木精染液中(即進即出)，再放入1%鹽酸乙醇分化2～3 s后，放入伊紅染液中1 min，再將玻片放入雙蒸水、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ各5 min、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各10 min，中性樹膠封固，顯微鏡拍片。分析對比圖片，以確定最佳的脊髓缺血再灌注損傷模型。

2 結(jié) 果

本實驗的12只家兔均進入結(jié)果分析，無脫落現(xiàn)象。

2.1 血管鑄型的結(jié)果 家兔鑄型標本的血管成型飽滿、疏密有度，能充分顯示家兔動脈血管及其走行，其中腰動脈、腹主動脈、左右腎動脈、腸系膜下動脈、等血管得到完整清晰的顯示。見圖1。

圖1 家兔血管鑄型標本中腰動脈完整鑄型Figure 1 Complete casting specimen of the lumbar arteries the rabbit

2.2 數(shù)字減影技術(shù)鑒定脊髓缺血再灌注模型 隨造影劑打入，各個部位的血管能逐步顯示出來。圖2分別為阻斷腰動脈未注入造影劑、阻斷腰動脈期間注入造影劑、去除阻斷注入造影劑3個時段所成的圖像。由圖2可見，阻斷腰動脈時，造影劑到達阻斷部位以后不能通過夾閉部位，當再次打開血管夾時，造影劑能再次進入被阻斷后的血管;圖3分別為阻斷腹主動脈未注入造影劑、阻斷腹主動脈注入造影劑、去除阻斷注入造影劑所成圖像。由圖3可見，阻斷腹主動脈時，造影劑到達阻斷部位以后不能通過夾閉部位，當打開血管夾時，造影劑能進入被阻斷后的血管。

圖2 數(shù)字減影技術(shù)鑒定阻斷腰動脈脊髓缺血再灌注的血供影像Figure 2 Blood supply in the spinal cord ischemia/reperfusion model by blocking the lumbar artery identified by DSA

圖3 數(shù)字減影技術(shù)鑒定阻斷腹主動脈脊髓缺血再灌注的血供影像Figure 3 Blood supply in the spinal cord ischemia/reperfusion model by blocking the abdominal aorta identified by DSA

2.3 夾閉腹主動脈及腰動脈脊髓組織HE染色結(jié)果通過HE染色對比可見，夾閉腹主動脈組脊髓組織明顯水腫、疏松，神經(jīng)細胞腫脹明顯，神經(jīng)元間隙增大，有空泡形成，神經(jīng)元胞體呈三角形并數(shù)量增多，胞核固縮偏位、碎裂溶解，核仁消失，細胞質(zhì)不均并嗜伊紅染色，白質(zhì)呈疏網(wǎng)狀改變，見圖4。夾閉腰動脈組脊髓組織神經(jīng)元損傷較夾閉腹主動脈組小，見圖5。

圖4 夾閉腹主動脈脊髓組織(HE×400)Figure 4 Spinal cord tissue after blocking the abdominal aorta(HE×400)

圖5 夾閉腰動脈脊髓組織(HE×400)Figure 5 Spinal cord tissue after blocking the lumbar arteries(HE×400)

3 討 論

理想的脊髓缺血再灌注損傷模型應具備以下特點:①所建立動物模型的損傷過程及傷后病理生理改變同人類脊髓缺血再灌注損傷盡可能相類似。②操作簡便，重復性好。本研究在Zivin傳統(tǒng)方法基礎上進行了一系列改良:首先實驗動物上選擇了來源豐富、體積較大的家兔［16］。Zivin法選擇于左腎動脈根部近端阻斷腹主動脈，并未提供足夠的依據(jù)。本實驗通過制作家兔動脈鑄型標本及數(shù)字減影攝片，發(fā)現(xiàn)于左腎動脈下方阻斷腰動脈能造成大部分腰段脊髓缺血。脊髓缺血時間的控制對篩選最佳的動物模型至關重要，早期的學者認為，缺血時間在17～60 min內(nèi)較為合適［17］。研究顯示，脊髓組織在一定時間內(nèi)(30 min)恢復血供，神經(jīng)元的功能可以得到恢復，如果超過這個時間范圍，神經(jīng)元將發(fā)生不可逆的損傷［18－19］。傳統(tǒng) Zivin法阻斷腹主動脈60 min，我們通過實驗發(fā)現(xiàn)，在常溫下于左腎或右腎動脈起始部近心端阻斷腹主動脈60 min，將造成家兔脊髓神經(jīng)不可逆損傷，不利于觀察藥物對神經(jīng)功能的影響。故本實驗采用的阻斷時間為30 min。

有研究表明:阻斷腹主動脈將同時造成腹、盆腔臟器缺血再灌注損傷，并發(fā)癥多［20－21］。由于小型實驗動物的腰動脈管徑小，不易尋找，甚至可能誤扎其他血管，故本實驗選擇體積較大型的新西蘭家兔［22－23］。本實驗采用血管鑄型技術(shù)詳細地分析家兔脊髓組織的血管走形，夾閉腰動脈(L3－6)和腹主動脈制成脊髓缺血再灌注損傷模型后采用數(shù)字減影血管造影技術(shù)鑒定并分析比較，通過HE染色可見，夾閉腹主動脈組脊髓組織明顯水腫、疏松，神經(jīng)細胞腫脹明顯，神經(jīng)元間隙增大，有空泡形成，神經(jīng)元胞體呈三角形并數(shù)量增多，胞核固縮偏位、碎裂溶解，核仁消失，胞質(zhì)不均并嗜伊紅染色，白質(zhì)呈疏網(wǎng)狀改變，而夾閉腰動脈組脊髓組織神經(jīng)元損傷較前者小。我們推測可能還有腸、腎等缺血的炎性因子導致神經(jīng)元的二次損害，因此神經(jīng)元細胞損害較大而且較多。

綜上所述，通過上述2種方法均能導致相應脊髓節(jié)段完全缺血，均可成功建立家兔脊髓缺血再灌注損傷模型，阻斷腹主動脈或胸主動脈會造成阻斷平面以下肌肉組織的大面積缺血，而阻斷腰動脈模型主要是阻斷脊髓血供及周圍少部分肌肉的血供，所以，阻斷腰動脈的造模方法優(yōu)于阻斷腹主動脈的造模方式，并發(fā)癥少，克服了傳統(tǒng)模型的缺陷，安全可靠，操作簡單，重復性好，更貼近臨床脊髓缺血再灌注損傷的病因與病理機制，使脊髓缺血再灌注損傷模型的建立更加具有說服力。

血管鑄型技術(shù)是解剖學標本制作的一項專門技術(shù)［24］，是一種直觀觀察血管分布的解剖方法。目前該技術(shù)主要用于血管分布狀況及微血管的檢測［25－26］。而數(shù)字減影技術(shù)是一種常規(guī)血管造影術(shù)和電子計算機圖像處理技術(shù)結(jié)合的X線成像系統(tǒng)，結(jié)合了常規(guī)血管造影術(shù)和電子計算機圖像處理技術(shù)，目前主要應用于血管性疾病的診斷和治療［27－29］。

血管鑄型標本的影響因素諸多。為更好地完成血管鑄型，首先，在暴露心臟時，動作要輕柔，注意不要剪傷周圍的動脈血管，以免加注鑄型劑時液體外漏。其次，插玻璃導管時應選取升主動脈近心端，用4.0手術(shù)線結(jié)扎，使玻璃管牢固的固定在升主動脈中，同時注意玻璃管尖端勿刺破血管、縫合線結(jié)扎時力度要適宜，防止縫合線割斷血管。第三，灌注鑄型劑時，用注射器接在玻璃管口回抽無液體被吸出時加入鑄型劑，灌注時所用的壓力和劑量要適當，防止壓力過大造成鑄型劑外漏和血管破裂。第四，將灌注好鑄型劑的標本放入鹽酸池中時，要將家兔擺好體位，并將家兔腹部及背部的皮膚剪開，以便鹽酸能更好的進入標本進行腐蝕。標本制作好后，修整標本時要注意保護標本，以免血管鑄型標本被折斷［30］。

在數(shù)字減影過程中，需注意以下因素:首先，要確保穿刺針進入血管，并固定牢固，防止穿刺針刺破血管導致造影劑外漏影響圖像采集;其次，最好應選擇孔徑較小且橡膠材質(zhì)的穿刺針;第三，在造影劑注入前及造影劑注入血管的全程采集圖像;第四，為了得到較好的圖像，盡快開胸并沿升主動脈注入造影劑;第五，注入造影劑要足量。在數(shù)字減影圖像中，我們可以明顯的看到，夾閉時腰動脈組造影劑無法從腰動脈進入脊髓組織，當再次打開血管夾時，造影劑就可以進入脊髓組織。這樣通過血管鑄型明確了家兔脊髓組織的血液供應血管走行情況，找到了為脊髓組織供應血液的動脈血管以及血管的走行;通過數(shù)字減影技術(shù)鑒定了缺血再灌注模型，通過夾閉動脈未注入造影劑、夾閉動脈后注入造影劑以及解除阻斷動脈再灌注3個時間點的對比得知，夾閉動脈之后，造影劑無法通過夾閉部位，夾閉位置以下的血管不能顯影，當我們打開血管夾時，造影劑可以通過血管。

夾閉腰動脈制作脊髓缺血再灌注損傷模型很好的模擬了臨床上脊髓缺血再灌注損傷的特征，避免了傳統(tǒng)脊髓缺血性動物模型的并發(fā)癥，是一個理想的動物模型，可以推廣使用。通過夾閉腰動脈制成的脊髓缺血再灌注損傷模型為今后脊髓缺血再灌注損傷治療及機制探討提供一個全新的平臺。

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