杜驍杰，郭靜靜，王 晶，李 敏，王 玲，王長軍，潘秀珍

0 引 言

蛋白質(zhì)磷酸化是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的核心，其中激酶和磷酸酶的協(xié)同作用介導(dǎo)著蛋白質(zhì)可逆的磷酸化，精確地調(diào)控細(xì)胞的各項(xiàng)生命活動(dòng)，包括細(xì)胞的生長、分裂、分化以及代謝等［1］。絲氨酸/蘇氨酸激酶(serine/threonine kinase，STK)和 STP是蛋白質(zhì)可逆性磷酸化的重要酶類，長期以來認(rèn)為其只存在于真核生物中，近年來的研究表明，在原核生物中也存在真核樣 STK 和磷酸酶［1－2］。

豬鏈球菌是一種重要的人獸共患病病原菌，目前對其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的研究主要集中在二元信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中［3－8］。我們的前期研究已分離出2型豬鏈球菌中國強(qiáng)毒株05ZYH33，對其進(jìn)行了全基因組測序分析［9］，發(fā)現(xiàn)和真核生物同源的stk/stp。本研究對stp進(jìn)行原核表達(dá)及純化，對純化的重組蛋白進(jìn)行酶活性測定，為進(jìn)一步闡明STK/STP磷酸化系統(tǒng)的調(diào)控機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和引物 2005年S.suis 2 05ZYH33分離自四川資陽中毒性休克綜合征患者。E.coli BL21、E.coli DH5α、pET28a 均由本實(shí)驗(yàn)室保存。pMD18-T購自Takara公司。對stp基因設(shè)計(jì)上下游引物，引物由上海賽百盛基因技術(shù)有限公司合成，堿基序列如下堿基序列如下:STP-L:CATATGATGGCTTTTTCATCGGTCA(下劃線為引入的Nde I酶切位點(diǎn))，STP-R:CTCGAGTTACCTAGCCTCCTCCGT(下劃線為引入的XhoⅠ酶切位點(diǎn))

1.1.2 試劑 Taq polymerase、dNTP、T4 DNA 連接酶、限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ、XhoⅠ、DNA Marker和質(zhì)粒提取試劑盒購自TaKaRa公司，蛋白Marker購自Fermentas公司，PCR割膠回收試劑盒購自promega公司，蛋白表達(dá)誘導(dǎo)劑IPTG購自南京生興生物公司。THB培養(yǎng)基購自美國Difco公司。HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG、鄰苯二胺(DAB)顯色液購于武漢博士德生物工程有限公司;His-Tag單克隆抗體購自上海艾比瑪特生物醫(yī)學(xué)有限公司。pNPP stock購于ScienCell(美國)公司。Tris購于南京百斯凱公司。MnCl2、MgCl2和CaCl2購于廣東汕頭西隴化工股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 stp的生物信息學(xué)分析 根據(jù)S.suis中國強(qiáng)致病株05ZYH33的全基因組序列和注釋結(jié)果，利用BLAST程序，對CDSSSU0427進(jìn)行在線比對，并對蛋白進(jìn)行保守功能域檢索。MEGA 5.0軟件繪制stp的進(jìn)化樹。

1.2.2 pET28a::stp的構(gòu)建 用引物對 STP-L/STPR擴(kuò)增05ZYH33 stp目的片段，將stp PCR產(chǎn)物連入pMD18-T并轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)，構(gòu)建成功后測序比對，命名為 pMD18-T-stp。pMD18-T-stp和pET28a用NdeⅠ/XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行回收，回收產(chǎn)物經(jīng)T4 DNA Ligase連接后轉(zhuǎn)化E.coli BL21，對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR和酶切鑒定，成功后命名為pET28a::stp。

1.2.3 pET28a::stp的表達(dá)及純化 將 pET28a::stp/BL21于5mL含Kana的LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，1∶100加入新鮮培養(yǎng)基后，37℃振蕩培養(yǎng)至A600值約0.6，加IPTG至終濃度為1 mmol/L，16℃誘導(dǎo)培養(yǎng)。離心收集菌體并用超聲波破碎細(xì)胞，離心后收集上清，利用Ni2+親和層析柱純化目的蛋白。12%SDSPAGE電泳檢測目的蛋白的相對分子質(zhì)量。

1.2.4 Western blot鑒定 取純化的STP重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，采用電轉(zhuǎn)印法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h;加His-Tag單克隆抗體(1∶4000)，4℃過夜;用HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶4000)孵育1 h;加DAB顯色液顯色。

1.2.5 酶活鑒定 參照文獻(xiàn)［10］，重組蛋白的磷酸酶活性檢測以pNPP為底物，通過測定A450值的變化間接檢測酶的活性。將2 μg重組蛋白STP與5 μL pNpp stock混合后加入事先配置的反應(yīng)緩沖液［含 1 μmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，2 mmol/L MnCl2、MgCl2或 CaCl2］，常溫孵育，每隔1 min 檢測 A405值。

2 結(jié) 果

2.1 05ZYH33 stp基因的生物信息學(xué)分析 通過Blastp比對發(fā)現(xiàn)STP蛋白的氨基酸序列與GenBank上的肺炎鏈球菌PhpP、變形鏈球菌pppL、無乳鏈球菌SaSTP和化膿鏈球菌SP-STP的氨基酸序列一致性分別為69%、59%、59%和60%。保守功能結(jié)構(gòu)域檢索發(fā)現(xiàn)STP屬于金屬依賴型磷酸酶家族PP2C亞家族，其在進(jìn)化上也較為保守。見圖1。

圖1 S.suis 2 05ZYH33 STP的生物信息學(xué)分析Figure 1 Bioinformation of STP

2.2 重組表達(dá)載體pET28a::stp的構(gòu)建和鑒定以05ZYH33基因組DNA為模板，STP-L/STP-R擴(kuò)增stp全長基因，擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為810 bp，與理論值一致。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物割膠回收進(jìn)行純化，與pMD18-T載體相連后測序，測序結(jié)果經(jīng)比對正確，將stp連入pET28a后構(gòu)建重組表達(dá)載體pET28a::stp，雙酶切結(jié)果證實(shí)了pET28a::stp的成功構(gòu)建。

圖2 重組質(zhì)粒的PCR及酶切鑒定Figure 2 Identification of the recombinant plasmid by PCR and restriction enzymes

2.3 pET28a::stp的表達(dá)及重組蛋白的純化pET28a::stp/BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，16℃下誘導(dǎo)培養(yǎng)，超聲波破碎細(xì)胞后離心收集上清及沉淀，SDS-PAGE分析表明，16℃下STP可正常表達(dá)，且主要存在于上清中。利用Ni2+親和層析柱對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化，250 mmol/L洗脫目的蛋白，透析去除咪唑，得到重組蛋白STP。見圖3。

圖3 pET28a::stp的誘導(dǎo)表達(dá)及STP純化檢測Figure 3 Expression of STP and the detection of purified STP protein

2.4 STP的 Western blot分析 Western blot結(jié)果顯示，STP可以和His-Tag單抗發(fā)生反應(yīng)，在蛋白相對分子質(zhì)量大小約32 000處有明顯的特異蛋白條帶，說明該重組蛋白的確是stp的表達(dá)產(chǎn)物。見圖4。

圖4 用His-Tag單抗對重組表達(dá)蛋白進(jìn)行免疫印跡檢測Figure 4 Western blot of the recombinant STP

2.5 重組蛋白磷酸酶活性的鑒定 用含有3種不同離子(Mn2+、Mg2+或Ca2+)的緩沖液孵育蛋白與作用底物的混合物，通過檢測A405值的變化，間接檢測磷酸酶的活性。我們發(fā)現(xiàn)，只有Mn2+存在下，STP才具有磷酸酶活性，提示該蛋白具有金屬離子依賴性。見圖5。

圖5 STP磷酸酶活性的間接檢測Figure 5 Phosphatase assays of STP

3 討 論

STP通過催化底物蛋白絲氨酸或蘇氨酸磷酸化羥基的去磷酸化，完成對信號(hào)的傳遞。根據(jù)分子結(jié)構(gòu)、對金屬離子的依賴性以及對抑制劑的敏感性的不同，STP被分為兩大家族，即磷蛋白磷酸酶(phosphoprotein phosphatase，PPP)和金屬依賴型磷酸酶(metal-dependent phosphatase，PPM)［11］。本研究在2型豬鏈球菌中發(fā)現(xiàn)STP編碼基因stp，生物信息學(xué)分析顯示STP蛋白屬于PPM家族PP2C亞家族，該亞家族成員結(jié)構(gòu)類似人蛋白質(zhì)磷酸酶2C［11］。其與常見致病菌株肺炎鏈球菌、無乳鏈球菌、化膿鏈球菌、變形鏈球菌STP蛋白具有很高的同源性，在進(jìn)化上具有保守性。

在枯草芽孢桿菌中，stk/stp激活細(xì)菌孢子萌發(fā)的轉(zhuǎn)錄因子［12］。在金黃色葡萄球菌中，stk/stp調(diào)節(jié)細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和對抗生素的敏感性［13］。無乳鏈球菌中，stk/stp影響著細(xì)菌的毒力和形態(tài)結(jié)構(gòu)［14－15］。目前對stk/stp系統(tǒng)的研究主要集中在stk中，單獨(dú)對stp的報(bào)道并不多見，且在某些菌株中stp是必須基因，對該基因不能進(jìn)行突變研究［16］。本課題組前期發(fā)現(xiàn) S.suis 2中國強(qiáng)毒株 05ZYH33 STK/STP編碼基因，對激酶 stk進(jìn)行敲除株的構(gòu)建［17］。本研究針對stk相鄰的磷酸酶stp開展相關(guān)研究，以05ZYH33基因組為模板擴(kuò)增出stp基因，將其連入表達(dá)載體pET28a并轉(zhuǎn)入宿主菌后進(jìn)行原核表達(dá)，親和層析獲得了純度較高的STP蛋白。

PPM家族蛋白的酶活性需要有金屬離子(Mg2+或Mn2+)的參與［11］，本實(shí)驗(yàn)間接地測定出重組STP蛋白的磷酸酶活性，且只有在Mn2+存在的條件下才具有該活性，在Mg2+或Ca2+存在下則沒有活性。本研究結(jié)果為進(jìn)一步闡明STK/STP系統(tǒng)在豬鏈球菌磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中的作用打下基礎(chǔ)。

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