王曉玥，陳曉辰，廖保生，王麗麗，韓建萍

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193)

基于DNA條形碼鑒定豆蔻類中藥材△

王曉玥，陳曉辰，廖保生，王麗麗，韓建萍*

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193)

目的：利用ITS2序列對(duì)豆蔻類中藥材進(jìn)行DNA條形碼鑒定研究。方法：本文采集了包括豆蔻兩個(gè)基原白豆蔻Amomumkravanh與爪哇白豆蔻Amomumcompactum、紅豆蔻Alpiniagalanga、草豆蔻Alpiniakatsumadai等在內(nèi)的70份樣品，采用試劑盒法提取基因組DNA，應(yīng)用Primer premier 5.0設(shè)計(jì)引物，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)擴(kuò)增其ITS2序列，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序，所得序列經(jīng)CodonCode Aligner V3.71拼接后，采用MEGA5.0 軟件進(jìn)行序列比對(duì)，計(jì)算種內(nèi)和種間距離，構(gòu)建鄰接樹(Neighbor-joining tree，NJ Tree)。ITS2序列采用基于隱馬爾可夫模型(Hidden Markov model，HMM)的注釋方法獲得。結(jié)果：通過新設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增的序列可以注釋到5.8 S與28 S，擴(kuò)增序列位于ITS2間隔區(qū)。采用新設(shè)計(jì)的引物，所有實(shí)驗(yàn)樣品均可獲得ITS2序列，NJ樹結(jié)果顯示不同種豆蔻類藥材分別聚為一支，可以互相區(qū)分，且可以與其混偽品相互區(qū)分。另外，通過序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)有5個(gè)SNP(s)存在于豆蔻與其它物種種間，且有2個(gè)穩(wěn)定的SNP(s)存在于白豆蔻和爪哇白豆蔻種間，可用于二者的準(zhǔn)確鑒定。結(jié)論：ITS2序列作為DNA條形碼可準(zhǔn)確穩(wěn)定地鑒別不同種豆蔻類藥材，本研究將為保障臨床安全用藥提供新的技術(shù)手段。

豆蔻；DNA條形碼；ITS2；物種鑒定

豆蔻之名始載于晉代藥學(xué)著作《名醫(yī)別錄》中[1]，同時(shí)其名也常出現(xiàn)在古代文學(xué)作品中，如唐代詩(shī)人杜牧有詩(shī)《贈(zèng)別》云：“娉娉婷婷十三余，豆蔻梢頭二月初?！闭f明豆蔻類中藥材在我國(guó)得到認(rèn)識(shí)已有很久的歷史。豆蔻在不同歷史時(shí)代中代表不同來源中藥材，各種豆蔻類藥材的名稱或外形類似，在本草記載中，同物異名或同名異物等情況常有出現(xiàn)，民間用藥混亂?，F(xiàn)常用品種為姜科豆蔻屬及山姜屬植物，如(白)豆蔻、草豆蔻、紅豆蔻等。由于姜科物種本身不易辨別，姜科豆蔻屬和山姜屬內(nèi)其他物種如草果、益智、砂仁等[1]較豆蔻類藥材不易區(qū)分，常成為此類藥材的混用品。如高良姜與紅豆蔻原植物外形相似，但是紅豆蔻所含揮發(fā)油較少[2-6]，香氣較淡[7]；草果與草豆蔻之間也時(shí)常存在混偽現(xiàn)象[8]等。本次實(shí)驗(yàn)所選擇的十種中藥材均被中國(guó)藥典(2010版)所收錄，如豆蔻為白豆蔻AmomumkravanhPierre ex Gagnep.或爪哇白豆蔻AmomumcompactumSoland ex Maton的干燥成熟果實(shí)[9]，紅豆蔻為大高良姜AlpiniagalangaWilld.的干燥成熟果實(shí)[10]，高良姜為高良姜AlpiniaofficinarumHance的干燥根莖[11]等。各藥材之間藥效差異較大，如草豆蔻具有行氣作用，草果卻沒有此作用；草果功效截瘧，可用以寒濕偏盛之瘧疾，而草豆蔻則無(wú)此作用[7]。

豆蔻類藥材采收年限較長(zhǎng)，如高良姜栽培一般4年收獲，種后5～6年收獲的，根莖含粉質(zhì)多，質(zhì)量更好，產(chǎn)量也高[12]；益智定植第3年開始開花結(jié)果，第5年才進(jìn)入豐產(chǎn)期[13]，故老百姓種植積極性不高，藥材市場(chǎng)緊缺。加之其在市場(chǎng)上混偽現(xiàn)象嚴(yán)重，故鑒定區(qū)分豆蔻類藥材具有重要性及必要性。為了解決幾種豆蔻類藥材的混偽情況，許多學(xué)者已在形態(tài)分類、化學(xué)成分研究方面做了許多研究。如豆蔻的兩種基原植物白豆蔻與爪哇白豆蔻，已有在顯微水平上對(duì)其鑒定區(qū)分的研究[14]，但是這些技術(shù)要求鑒定者具有豐富的解剖學(xué)、組織學(xué)或化學(xué)知識(shí)，對(duì)于沒有豐富經(jīng)驗(yàn)的人員而言，鑒定較困難。

DNA條形碼(DNA barcoding)技術(shù)作為一種新興的分子鑒定手段，即利用基因組中一段公認(rèn)的、相對(duì)較短的DNA序列來進(jìn)行物種鑒定的一種分子生物學(xué)技術(shù)，是傳統(tǒng)形態(tài)鑒別方法的有效補(bǔ)充，近年來成為國(guó)內(nèi)外生物分類和鑒定的研究熱點(diǎn)[15]，在Nature，Science等學(xué)術(shù)刊物和National Geographic News、The New York Times等媒體上大量報(bào)道[16]，該技術(shù)具有便捷、快速、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，在藥用植物的鑒定和瀕危物種的保護(hù)中具有廣闊的應(yīng)用前景[17-18]。該種方法的出現(xiàn)，極大地提高了物種鑒定效率及其準(zhǔn)確性，與傳統(tǒng)方法相比，在通用性與可數(shù)字化方面具有明顯優(yōu)勢(shì)[19]。韓建萍等[20]發(fā)現(xiàn)，ITS2序列可以作為洋金花及其偽品鑒定用的條形碼序列；朱英杰等[21]對(duì)重樓屬11個(gè)物種的ITS2，psbA-trnH，rpoB，rbcL，matK等序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明ITS2序列鑒定效率為100%。Chen等[22]通過對(duì)大量研究的系統(tǒng)整理提出，ITS2序列可以作為標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼鑒別藥用植物，并在通過對(duì)大樣本量藥用植物研究的基礎(chǔ)上，建立了以ITS2序列為主，psbA-trnH序列為輔的中藥材DNA條形碼分子鑒定體系[23-24]，Yao等[25]也通過大樣本量分析證實(shí)ITS2序列可以作為植物物種鑒別的通用條形碼。

本研究主要從分子水平著手，通過DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)化流程，對(duì)豆蔻類藥材進(jìn)行鑒定，并且建立該類藥材的鑒定方法體系，以滿足非形態(tài)學(xué)或分子生物學(xué)專業(yè)人員對(duì)豆蔻類藥材進(jìn)行鑒定的需求，將為確保藥材的質(zhì)量及臨床用藥安全提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

以姜科豆蔻屬與山姜屬10個(gè)物種共125個(gè)樣本為研究對(duì)象，實(shí)驗(yàn)樣品植物材料來源見表1，GenBank登錄號(hào)等信息詳見表2。其中70份實(shí)驗(yàn)材料樣品來自全國(guó)各大藥市、藥店，如安徽亳州藥材市場(chǎng)、河北安國(guó)藥材市場(chǎng)、北京各大藥店、四川成都荷花池藥市等；原植物樣本采自云南西雙版納熱帶植物園、華南植物園和中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所及云南分所、廣州中醫(yī)藥大學(xué)等地，憑證標(biāo)本存放于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所標(biāo)本館。其余55個(gè)樣品來源于GenBank。

1.2 樣品DNA提取、PCR擴(kuò)增與測(cè)序

1.2.1 DNA提取 取種子或果實(shí)類樣品約50 mg，葉片類樣品20 mg；根及根莖類樣品取樣前，用酒精擦拭表面，切去樣品表皮，取內(nèi)部樣約35 mg。用DNA提取研磨儀研磨2 min(30次/s)。采用植物基因組DNA提取試劑盒(Tiangen Biotech Co.，China)提取總DNA。

表1 實(shí)驗(yàn)樣品信息表

表2 GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)獲得豆蔻類藥材及混偽品ITS2序列GenBank登錄號(hào)信息

1.2.2 PCR擴(kuò)增 本研究初期，使用通用引物ITS 2F/3R[22]進(jìn)行序列擴(kuò)增，但是發(fā)現(xiàn)該引物在部分實(shí)驗(yàn)所用豆蔻類藥材(爪哇白豆蔻、白豆蔻、草果、草豆蔻、紅豆蔻、高良姜)序列擴(kuò)增中效率較低，無(wú)法達(dá)到測(cè)序要求，因此我們針對(duì)豆蔻類藥材設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增ITS2區(qū)段。利用GenBank下載的同屬物種ITS2序列兩端的5.8 S和28 S保守序列，使用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，檢查引物長(zhǎng)度、引物二級(jí)結(jié)構(gòu)(包括引物自身二聚體、發(fā)卡結(jié)構(gòu)、引物間二聚體等)、引物GC含量等是否符合要求，最終設(shè)計(jì)引物為ITSHF(20 bp)/ITSHR(20 bp)，引物交由生工生物工程(上海)股份有限公司北京合成部合成(具體引物信息及擴(kuò)增程序見表3)。PCR反應(yīng)體積為25 μL，體系內(nèi)含MgCl22 μL(25 mM)、dNTP 2 μL(2.5 mmol·L-1)、PCR buffer 2.5 μL(10×)、引物各1.0 μL(2.5 μmol·L-1)、Taq DNA聚合酶1.0 U、總DNA約2 μL。通過優(yōu)化其PCR擴(kuò)增程序，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明該引物對(duì)豆蔻類中藥材的PCR擴(kuò)增效果優(yōu)于通用引物ITS 2F/3R。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后，使用ABI 3730XL測(cè)序儀雙向測(cè)序。

表3 PCR引物及擴(kuò)增程序

1.2.3 序列拼接和數(shù)據(jù)分析方法 測(cè)序峰圖釆用序列拼接軟件CodonCode Aligner V3.71(CodonCode，Dedham，MA，USA)校對(duì)拼接，去除低質(zhì)量序列及引物區(qū)。研究涉及的全部實(shí)驗(yàn)以及下載ITS2序列，采用基于隱馬爾可夫模型的HMM注釋方法去除兩端5.8S和28S區(qū)段即可獲得ITS2間隔區(qū)序列[26]。然后，將所有序列用軟件MEGA5.0(molecular evolutionary genetics analysis)分析比對(duì)[27]，用鄰接(Neighbor-Joining，NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹，通過Bootstrap(1 000次重復(fù))檢驗(yàn)各分支的支持率，并基于K-2P遺傳模型進(jìn)行遺傳距離等分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ITS2序列長(zhǎng)度及GC含量比較

研究所用10個(gè)物種的ITS2片段序列的長(zhǎng)度范圍為218～309 bp，GC含量范圍為55.23%～63.30%，豆蔻類藥材及其混偽品之間在ITS2序列長(zhǎng)度上存在差異，詳見表4。

2.2 豆蔻類藥材及其混偽品種間變異分析

利用MEGA 5.0輸出的變異位點(diǎn)見圖1(序列完全相同樣品只列出一個(gè)作為代表)，種間變異較豐富。應(yīng)用MEGA5.0對(duì)種間和種內(nèi)K-2P距離進(jìn)行計(jì)算，由表5中K-2P遺傳距離結(jié)果表明，爪哇白豆蔻與白豆蔻各自的種內(nèi)遺傳距離大于它們之間的種間遺傳距離，表示兩個(gè)物種親緣關(guān)系較近，沒有Barcoding-GAP；其余物種的種內(nèi)遺傳距離均小于其與其他物種種間遺傳距離，即通過ITS2序列可以很好地鑒別實(shí)驗(yàn)物種。

表4 不同物種ITS2長(zhǎng)度及GC含量

表5 實(shí)驗(yàn)用豆蔻類藥材種內(nèi)種間距離(注：最小距離～最大距離(平均距離))

分析親緣關(guān)系較近、種間差異很小的物種，SNP位點(diǎn)解析是一個(gè)有力工具。所以對(duì)于利用遺傳距離不易區(qū)分的爪哇白豆蔻與白豆蔻，可以采用SNP位點(diǎn)進(jìn)行鑒別。對(duì)研究所涉及的10個(gè)物種的變異位點(diǎn)(圖1)進(jìn)行分析，結(jié)果標(biāo)明豆蔻的兩個(gè)基原可以與其它實(shí)驗(yàn)藥材明顯分開(表6)。豆蔻兩個(gè)基原的ITS2序列長(zhǎng)度均為218 bp，對(duì)其變異位點(diǎn)(圖2)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：61 bp處爪哇白豆蔻均為C，而白豆蔻均為T；202 bp處，爪哇白豆蔻均為T，而白豆蔻均為C。由此就可以用兩個(gè)位點(diǎn)將白豆蔻與爪哇白豆蔻區(qū)分開。對(duì)GenBank中所示豆蔻的ITS2序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明這兩個(gè)SNP(s)位點(diǎn)穩(wěn)定地存在于兩個(gè)基原物種間。綜上所述，ITS2序列的SNP位點(diǎn)能明顯的將兩種豆蔻鑒別開。

圖1 MEGA輸出各物種單倍型及變異位點(diǎn)(Aligned By Muscle)

表6 豆蔻與其它實(shí)驗(yàn)藥材SNP位點(diǎn)分析

2.3 豆蔻類藥材及其混偽品的NJ樹鑒定

基于ITS2序列構(gòu)建豆蔻類藥材及其混偽品NJ樹(圖3)，結(jié)果表明本次實(shí)驗(yàn)研究的幾種豆蔻類藥材各自聚為一支，其中，爪哇白豆蔻與白豆蔻親緣關(guān)系較近，在樹的一支上，最終分為兩小支，說明NJ樹可以將爪哇白豆蔻與白豆蔻鑒別開，其它豆蔻類藥材之間建樹時(shí)區(qū)分支持率較高。同時(shí)豆蔻類藥材均可與從GenBank下載的混偽品ITS2序列很明顯區(qū)分開。因此，ITS2序列作為DNA條形碼可準(zhǔn)確鑒別不同種豆蔻類藥材及其混偽品。

圖2 MEGA輸出爪哇白豆蔻與白豆蔻變異位點(diǎn)

圖3 基于ITS2序列構(gòu)建的豆蔻類藥材及其混偽品的鄰接(NJ)樹

3 討論

3.1 DNA條形碼鑒定準(zhǔn)確性與穩(wěn)定性分析

豆蔻類藥材以果實(shí)或根莖入藥，基原植物均來源于姜科，具有相近氣味。有些物種之間形態(tài)類似，如白豆蔻與爪哇白豆蔻，顯微鑒別時(shí)有微小區(qū)別；有些物種之間名稱類似，如草豆蔻與草果故藥用豆蔻類藥材混淆現(xiàn)象嚴(yán)重。且豆蔻類藥材常作為香料使用，有時(shí)要提取香精等，提取時(shí)已破壞其原植物或原藥材性狀特征，使鑒定更加困難，而從分子水平上鑒定不受其形態(tài)等影響。豆蔻類藥材之間功效不盡相同，混用會(huì)造成用藥不安全，故鑒別豆蔻類藥材是非常迫切的。無(wú)論從所選的10個(gè)物種的豆蔻類藥材種內(nèi)、種間遺傳距離，還是基于ITS2條形碼序列構(gòu)建的NJ樹，均證實(shí)ITS2條形碼序列能夠準(zhǔn)確地將豆蔻類藥材鑒別開來。對(duì)于豆蔻的兩個(gè)基原物種(白豆蔻與爪哇白豆蔻)而言，根據(jù)K-2P遺傳距離分析，爪哇白豆蔻與白豆蔻各自的種內(nèi)遺傳距離大于它們之間的種間遺傳距離，在NJ樹上它們各自聚為一支，說明它們利用ITS2序列可以鑒別區(qū)分。同時(shí)用SNP位點(diǎn)也能很好將兩個(gè)基原物種區(qū)分，說明ITS2條形碼序列能夠準(zhǔn)確地鑒別豆蔻類藥材。

所謂鑒定穩(wěn)定性是指對(duì)于不同產(chǎn)地、不同批次的樣品而言，通過實(shí)驗(yàn)均能夠穩(wěn)定地獲得DNA條形碼序列。本實(shí)驗(yàn)采用豆蔻類藥材進(jìn)行DNA提取，設(shè)計(jì)特異引物擴(kuò)增ITS2 序列，70份藥材和原植物樣品均可成功獲取ITS2序列，證明ITS2序列作為豆蔻類藥材DNA條形碼具有很好的穩(wěn)定性。

3.2 DNA條形碼在實(shí)際鑒定工作中的意義

豆蔻類藥材是傳統(tǒng)的常用中藥材，但在不同歷史時(shí)期或不同地區(qū)，對(duì)于豆蔻類中藥材的認(rèn)識(shí)不同，所使用的藥材來源也不相同。如大高良姜(紅豆蔻)，古代所用紅豆蔻為山姜屬植物，但很難鑒定到種?，F(xiàn)在民間，仍然有把果實(shí)紅色的山姜屬植物用作紅豆蔻的情況。由此可見，豆蔻類藥材在市場(chǎng)上流通的混偽品較常見，只有具有豐富的藥材鑒別能力的人員才能準(zhǔn)確區(qū)分開正品與混偽品。而DNA條形碼優(yōu)點(diǎn)在于，其在鑒定過程中不受藥材性狀的影響，是直接從基因水平上提供鑒定依據(jù)，因此，即便是沒有豐富的藥材鑒別經(jīng)驗(yàn)的人員，通過DNA條形碼的標(biāo)準(zhǔn)化流程，即可準(zhǔn)確區(qū)分藥材正偽品。因此可知，采用DNA條形碼技術(shù)，可以更加準(zhǔn)確、快速地完成中藥材鑒定工作，對(duì)于今后藥材市場(chǎng)中藥材的流通、市場(chǎng)管理等實(shí)際應(yīng)用均具有極大的價(jià)值。

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IdentificationofAmomiFructusRotundusBasedonDNABarcoding

WANG Xiaoyue，CHEN Xiaochen，LIAO Baosheng，WANG Lili，HAN Jianping*

(InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalSciences，Beijing100193，China)

Objective:In this study，the internal transcribed spacer 2 of nuclear ribosomal DNA(ITS2)sequence was used for identifying the traditional Chinese medicine fromAmomumandAlpiniato ensure the quality medicines and clinical efficacy.Genomic DNA was extracted from 70 samples using Genomic DNA kit and used as templates for Polymerase Chain Reaction(PCR).Sequences assembly and consensus sequence generation were performed by Codoncode Aligner.The intraspecific and interspecific genetic distances were computed and the neighbor-joining tree was constructed by MEGA 5.0 in accordance with the kimura 2-parameter(K-2P)model.The ITS2 regions were obtained by using the hidden Markov model(HMM)-based annotation methods from the ITS2 sequence.Results：With the specific designed primers，ITS2 sequences can be obtained from all samples.Every species clustered into a clade in the neighbor-joining phylogenetic trees(NJ tree)respectively，and can be accurately separated with other varieties and adulterants.In addition，we can find some SNP(s)among Fructus Amomi Rotundus and other experiment species by comparing ITS2 sequences，andAmomumcompactumandAmomumkravanhcan be distinguished well through two stable SNPs.Conclusion：ITS2 region could be used as an efficient barcoder to identify the traditional Chinese medicine fromAmomumandAlpinia.This study could provide a new technique to ensure clinical safety in utilization Chinese medicines.

Amomi Fructus Rotundus；DNA barcoding；ITS2；species identification

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.11.003

2014-10-05)

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81473303)：太白貝母甾體生物堿生物合成途徑的比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究

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韓建萍，副研究員，主要研究方向：中藥資源及分子鑒定，Tel：(010)57833198，E-mail：jphan@implad.ac.cn