佘 歆 黃耀鵬 陳文俊 殷仕玲

一、引言

被害人或犯罪分子只要出現(xiàn)開(kāi)放性損傷，犯罪現(xiàn)場(chǎng)就會(huì)遺留血跡。由于一些因素的影響，如犯罪人沖洗犯罪現(xiàn)場(chǎng)，或者年代久遠(yuǎn)，事物變遷，沾有血跡的部位、物品無(wú)意識(shí)地被破壞，都會(huì)影響勘查人員發(fā)現(xiàn)潛在的血跡。傳統(tǒng)上，要憑借勘查人員的經(jīng)驗(yàn)，借助多種光源和光學(xué)儀器來(lái)搜索血跡，但這種方法只能搜尋到與周圍客體有一定反差的血痕①孫野：《命案現(xiàn)場(chǎng)中血跡的魯米諾和二氫熒光素搜尋方法探析》，《吉林公安高等?？茖W(xué)校學(xué)報(bào)》2006年第4期。，對(duì)于反差較弱或者根本沒(méi)有反差的潛在血跡就無(wú)能為力，且效率低下。有關(guān)資料表明，可以使用隱色龍膽紫、二氫熒光素、無(wú)色孔雀綠、氨基黑10B、四甲基聯(lián)苯胺和魯米諾等試劑與血液中的物質(zhì)作用，使?jié)撛谘E產(chǎn)生肉眼可以觀察到的顏色變化或熒光反應(yīng)，從而達(dá)到顯現(xiàn)的目的。隨著 DNA技術(shù)廣泛應(yīng)用，通過(guò)對(duì)血跡進(jìn)行檢驗(yàn)鑒定，可以直接認(rèn)定人身。因而潛在血跡顯現(xiàn)劑是否對(duì)后期DNA檢測(cè)產(chǎn)生影響，受到刑事技術(shù)人員的關(guān)注。本課題組研究了六種血跡顯現(xiàn)劑對(duì)不同潛在血跡在不同載體和背景下的顯現(xiàn)效果，以及對(duì) DNA檢測(cè)的影響，為犯罪現(xiàn)場(chǎng)潛在血跡的發(fā)現(xiàn)提供最佳的顯現(xiàn)方法。

二、實(shí)驗(yàn)材料和儀器

1．血跡顯現(xiàn)主要試劑及儀器

熒光素、魯米諾、孔雀綠、TMB、龍膽紫、氨基黑10B等試劑，試劑均為分析純，試驗(yàn)用水均為二次去離子水；多波段光源、移液器、電子天平、加熱儀器、噴霧器、照相機(jī)等儀器。

2．試劑的配制

（1）隱色龍膽紫。將0.5g龍膽紫溶于100ml醋酸中，溶解后加入鋅粉和鋅粒各10g，攪拌后置室溫下自然脫色，至溶液變?yōu)闊o(wú)色。然后再加入8g鋅粒，以保持溶液的穩(wěn)定性。靜置24小時(shí)，取其上部清液備用。①公安部政治部：《血跡形態(tài)分析》，中國(guó)人民公安大學(xué)出版社2007年版，第95-98頁(yè)。

（2）二氫熒光素。將1克熒光素溶于100mL10%的氫氧化鈉溶液，加熱，加入10克鋅粉至達(dá)到沸點(diǎn)（注:鋅并不會(huì)溶解）。溶液的顏色在這一時(shí)段內(nèi)會(huì)逐漸消褪。將溶液冷卻并等到鋅粉沉淀。謹(jǐn)慎地將溶液倒出，并保持鋅粉不被倒出來(lái)。將1份倒出的溶液與19份去離子水完全混合，此為A液。B液為10%的過(guò)氧化氫溶液。②孫野：《命案現(xiàn)場(chǎng)中血跡的魯米諾和二氫熒光素搜尋方法探析》，《吉林公安高等專科學(xué)校學(xué)報(bào)》2006年第4期。

（3）無(wú)色孔雀綠。將2g孔雀綠、8g鋅粉、50ml冰醋酸混合加熱至完全脫色，取上述溶液25ml，與100mL乙醚和0.5mL30%過(guò)氧化氫溶液混合，充分?jǐn)嚢瑁瞥娠@現(xiàn)液。③公安部政治部：《血跡形態(tài)分析》，中國(guó)人民公安大學(xué)出版社2007年版，第95-98頁(yè)。

（4）氨基黑10B。將1g氨基黑10B溶于5ml醋酸和95ml無(wú)水乙醇的混合溶液，此為A液。B液為100ml醋酸與900ml無(wú)水乙醇的混合溶液。

（5）四甲基聯(lián)苯胺（TMB）。1gTMB溶于100ml無(wú)水乙醇，此為A液。B液為30%過(guò)氧化氫。④公安部政治部：《血跡形態(tài)分析》，中國(guó)人民公安大學(xué)出版社2007年版，第95-98頁(yè)。

（6）魯米諾。將5g無(wú)水碳酸鈉溶于100ml蒸餾水中，再加入魯米諾1g，制成儲(chǔ)存液，棕色瓶中冷藏避光保存。使用時(shí)取出部分溶液，按照100:6的體積比加入30%過(guò)氧化氫溶液配制成魯米諾工作液。

3． DNA檢測(cè)主要試劑及儀器

SiO2懸濁液、Tris-HCl、EDTA、SLS、HiDi、Liz 500等試劑；中國(guó)東勝龍 ETC-811加熱儀、美國(guó)AB公司 9700擴(kuò)增儀、美國(guó)AB 公司3500XL檢測(cè)儀等儀器；擴(kuò)增使用美國(guó)AB公司 Identifiler Plus試劑盒。

三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1．樣本的制備

（1）血樣的制備。血液樣本均來(lái)自同一人同一時(shí)期抽取的血液。血液沒(méi)有受到任何形式的抗凝血?jiǎng)┗蚱渌廴疚镂廴?。血液抽取完畢后立即稀釋，分別制作未稀釋血樣以及稀釋程度（血液：水）分別為1:10、1:100、1:500、1:1000的血樣。

（2）實(shí)驗(yàn)樣本的制備。實(shí)驗(yàn)所用載體可分為滲透性和非滲透性兩大類。非滲透性載體采用淺色瓷磚和深色瓷磚，滲透性載體采用淺色布和深色布。將上述五種不同濃度的血樣分別滴加在四種載體上，并在每種載體上標(biāo)記血樣濃度，一共制作七組這樣的樣本。1至6組分別使用隱色龍膽紫、二氫熒光素、無(wú)色孔雀綠、氨基黑10B、四甲基聯(lián)苯胺、魯米諾六種方法進(jìn)行顯現(xiàn)，第7組為空白對(duì)照組。

2．血跡的顯現(xiàn)

（1）隱色龍膽紫。滴加隱色龍膽紫溶液至第1組中各載體上，再滴加10滴30%過(guò)氧化氫溶液（使兩溶液充分接觸反應(yīng)），等待幾秒鐘，拍照記錄。

（2）二氫熒光素。將A液裝入1號(hào)噴霧器、B液裝入2號(hào)噴霧器，將1號(hào)噴霧器內(nèi)的溶液在距離載體30~45cm處噴灑于第2組中各載體上。用相同的方式噴灑兩次。等待幾秒鐘，再噴灑2號(hào)噴霧器內(nèi)的液體。用多波段光源照射于第2組上各個(gè)載體，并用裝有黃色濾光鏡相機(jī)拍照記錄。

（3）無(wú)色孔雀綠。將無(wú)色孔雀綠顯現(xiàn)液涂抹于第3組中各載體上，等待幾秒鐘，拍照記錄。

（4）氨基黑10B。用A液充分涂抹于第4組中各載體上，再用B液漂洗，拍照記錄。

（5）四甲基聯(lián)苯胺。將A液與B液以5:1混合，將混合液滴加于第5組中各載體上，等待幾秒鐘，拍照記錄。

（6）魯米諾。暗室中，將魯米諾工作液裝入噴霧器，將噴霧器內(nèi)的溶液在距離載體30~45cm處噴灑于第6組中各載體上，迅速拍照記錄。

3．DNA檢測(cè)

（1）血跡及DNA的提取。分別對(duì)六種顯現(xiàn)方法在淺布、深布、淺瓷和深瓷四種載體上處理過(guò)的不同濃度的血跡進(jìn)行提取，氨基黑10B在滲透性載體上的除外。其中對(duì)于滲透性載體（淺色布、深色布）上的血跡采用剪取原物的提取方法，對(duì)于非滲透性載體（淺色瓷磚、深色瓷磚）上的血跡采用棉簽擦拭的方法。對(duì)空白組采用相同方法處理。將提取好的血跡通過(guò)硅珠法進(jìn)行 DNA提?。ㄏ?、洗滌、洗脫）。①鄭秀芬：《法醫(yī)DNA分析》，中國(guó)人民公安大學(xué)出版社2002年版，第43-44頁(yè)。

（2）PCR擴(kuò)增及檢測(cè)。使用Identifiler Plus試劑盒分別對(duì)各組提取待用的DNA模板進(jìn)行28循環(huán)擴(kuò)增后進(jìn)行結(jié)果檢測(cè)，并通過(guò)GeneMapper ID-X軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

四、結(jié)果與討論

1．不同方法的顯現(xiàn)效果比較

分別使用隱色龍膽紫、二氫熒光素、無(wú)色孔雀綠、氨基黑10B、四甲基聯(lián)苯胺、魯米諾六種方法對(duì)淺布、深布、淺瓷和深瓷四種載體上的不同濃度的血跡進(jìn)行顯現(xiàn)，顯現(xiàn)結(jié)果見(jiàn)表 1。結(jié)果中+++、++、+、-、o的效果見(jiàn)圖1。

2．DNA檢測(cè)結(jié)果

分別對(duì)隱色龍膽紫、二氫熒光素、無(wú)色孔雀綠、四甲基聯(lián)苯胺、魯米諾這五種顯現(xiàn)方法在淺布、深布、淺瓷和深瓷四種載體上處理過(guò)的不同濃度的血跡以及氨基黑10B在淺瓷和深瓷兩種載體上處理過(guò)的不同濃度的血跡進(jìn)行提取。其中，對(duì)于滲透性載體（淺色布、深色布）上的血跡采用剪取原物的提取方法，對(duì)于非滲透性載體（淺色瓷磚、深色瓷磚）上的血跡采用棉簽擦拭的方法。將提取好的血跡通過(guò)硅珠法進(jìn)行DNA提取，并使用Identifiler Plus試劑盒進(jìn)行28循環(huán)擴(kuò)增后進(jìn)行結(jié)果檢測(cè)，未經(jīng)顯現(xiàn)劑處理的空白組中某一樣本的DNA圖譜，見(jiàn)圖2。通過(guò)GeneMapper ID-X軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各組分析結(jié)果，見(jiàn)表2。

對(duì)未經(jīng)顯現(xiàn)劑處理的空白組通過(guò)相同方法進(jìn)行 DNA檢測(cè)，得出在淺布、深布、淺瓷和深瓷四種載體上未處理過(guò)的不同濃度的血跡均能通過(guò)以上方法檢測(cè)出16個(gè)有效位點(diǎn)。檢出有效位點(diǎn)的統(tǒng)計(jì)，排除了位點(diǎn)熒光強(qiáng)度較低、出峰不全、有雜峰干擾等情況。

表1 各組血跡的顯現(xiàn)結(jié)果

圖1 不同顯現(xiàn)效果說(shuō)明

3．討論

圖2 未經(jīng)顯現(xiàn)劑處理的血液在淺瓷上稀釋程度為1∶100的DNA圖譜

表2 各組DNA檢驗(yàn)的位點(diǎn)數(shù)

圖3 二氫熒光素和魯米諾的顯現(xiàn)效果

（1）血跡濃度對(duì)顯現(xiàn)效果的影響。從表1可以看出，除氨基黑10B由于無(wú)法脫色不能在滲透性載體上使用外，未稀釋血跡采用另外五種方法的顯現(xiàn)效果都非常明顯。對(duì)于稀釋后的血跡，在滲透性和非滲透性載體上稀釋程度大于1:100時(shí)顯現(xiàn)效果均有明顯下降的趨勢(shì)，但是二氫熒光素和魯米諾在稀釋程度為1:1000時(shí)仍有較好的顯現(xiàn)效果（見(jiàn)圖3），這是因?yàn)闊晒夂突瘜W(xué)發(fā)光的靈敏度比較高。

（2）載體背景對(duì)顯現(xiàn)效果的影響。載體背景對(duì)六種顯現(xiàn)方法的效果均有影響，淺色背景下的顯現(xiàn)效果明顯優(yōu)于深色背景。這是由于六種顯現(xiàn)方法中，隱色龍膽紫、無(wú)色孔雀綠、氨基黑10B、四甲基聯(lián)苯胺都是使有血跡部位分別呈藍(lán)紫色、翠綠色、藍(lán)黑色和藍(lán)綠色，因此，深色背景對(duì)這些顏色有干擾。而二氫熒光素和魯米諾是使有血跡部位產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，因此，背景顏色對(duì)這兩種方法的顯現(xiàn)效果影響較小。

（3）其他因素的干擾。案發(fā)現(xiàn)場(chǎng)的環(huán)境較為復(fù)雜，在實(shí)際顯現(xiàn)過(guò)程中，會(huì)受到各種因素的影響，通過(guò)這六種方法顯現(xiàn)后即使結(jié)果呈陽(yáng)性，也不能確定該位置一定存在血跡。隱色龍膽紫、無(wú)色孔雀綠和四甲基聯(lián)苯胺的顯現(xiàn)原理主要是血液中存在的過(guò)氧化氫酶及血卟啉使過(guò)氧化氫釋放出初生態(tài)氧，從而氧化隱色龍膽紫、無(wú)色孔雀綠和四甲基聯(lián)苯胺，使有血跡部位呈現(xiàn)不同顏色顯出。因此，現(xiàn)場(chǎng)只要存在能釋放出初生態(tài)氧的物質(zhì)，對(duì)血跡顯現(xiàn)都有一定干擾，例如四甲基聯(lián)苯胺能與果汁發(fā)生顯色反應(yīng)。氨基黑10B是一種生物染色劑，對(duì)血液中的蛋白質(zhì)進(jìn)行染色。因此，即使現(xiàn)場(chǎng)物質(zhì)被氨基黑10B染呈藍(lán)黑色，也并不能確定其就是血跡。二氫熒光素和魯米諾的顯現(xiàn)原理主要是過(guò)氧化氫在血液中鐵元素催化下分解，從而與二氫熒光素和魯米諾兩者反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。如魯米諾與次氯酸漂白劑也能產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。①石美森：《生物學(xué)證據(jù)研究與應(yīng)用》，法律出版社2012年版，第3-6頁(yè)。因此，還需要將現(xiàn)場(chǎng)初步顯現(xiàn)的疑似血跡提取后進(jìn)行確證試驗(yàn)以確定其為血跡。

（4）六種顯現(xiàn)方法對(duì)DNA檢測(cè)的影響。從表2可以看出，在非滲透性載體上，經(jīng)過(guò)四甲基聯(lián)苯胺顯現(xiàn)后的血跡的DNA檢測(cè)結(jié)果最好，缺失的位點(diǎn)最少，其次為氨基黑10B、二氫熒光素和魯米諾。滲透性體載體上血跡的DNA檢測(cè)效果普遍不如非滲透性載體上血跡的DNA檢測(cè)效果，其中經(jīng)過(guò)魯米諾顯現(xiàn)后的血跡的DNA檢測(cè)效果最好。

（5）各種顯現(xiàn)方法的局限性。六種顯現(xiàn)方法都有一定的局限性。隱色龍膽紫、無(wú)色孔雀綠和四甲基聯(lián)苯胺的顯現(xiàn)效果不佳；氨基黑10B由于無(wú)法脫色不能在滲透性載體上使用；二氫熒光素保存期限較短，必須現(xiàn)配現(xiàn)用；魯米諾必須在黑暗的環(huán)境下使用且發(fā)光時(shí)間短暫，難以拍照記錄。六種顯現(xiàn)方法都會(huì)對(duì)后期 DNA檢測(cè)造成不同程度的影響。因此，實(shí)際案發(fā)現(xiàn)場(chǎng)中應(yīng)首先使用多種強(qiáng)光源搜尋疑有血跡的部位，非滲透性載體上會(huì)留下血跡的輪廓，滲透性載體上血跡往往會(huì)滲入其中。而這六種顯現(xiàn)方法應(yīng)作為其他方法無(wú)法發(fā)現(xiàn)潛在血跡的前提下最后的選擇。

五、結(jié)論

研究結(jié)果表明，現(xiàn)場(chǎng)潛在血跡可以通過(guò)隱色龍膽紫、無(wú)色孔雀綠、氨基黑10B、四甲基聯(lián)苯胺、二氫熒光素和魯米諾試劑進(jìn)行顯現(xiàn)，顯現(xiàn)效果以后兩項(xiàng)為佳，不僅可以有效的顯現(xiàn)稀釋程度為1:1000的血跡，而且能排除載體背景的干擾；通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)比較了六種潛在血跡顯現(xiàn)劑對(duì)后期DNA檢測(cè)影響情況，六種顯現(xiàn)劑在不同程度上對(duì) DNA檢測(cè)均有一定的影響，其中以魯米諾試劑影響較小，比較適合應(yīng)用于犯罪現(xiàn)場(chǎng)潛在血跡的顯現(xiàn)。