李崇奇+周鵬+蔡望偉

基金項目 海南省研究生創(chuàng)新科研課題（Hyb2012-2）；海南醫(yī)學院科研培育基金（HY2013-18）。

摘要應用miRtour在線分析工具對猴面花GSS序列進行分析，預測猴面花的miRNA序列，應用psrobot預測 miRNA的靶基因。結果發(fā)現(xiàn)50條不同的猴面花miRNA成熟序列，尿嘧啶在miRNA 5′端第1堿基出現(xiàn)頻率最高，有64條編碼序列受到猴面花miRNA的調(diào)控。靶基因中有15個編碼轉(zhuǎn)錄因子，有21個編碼酶。

關鍵詞猴面花；miRNA；生物信息學；GSS序列

中圖分類號Q74文獻標識碼A文章編號 1007-5739（2014）11-0345-03

BioinformaticsStudyonmiRNAinMimulusgutatusBasedonGSSSequences

LI Chong-qi 1，2，3ZHOU Peng 2，3CAI Wang-wei 1 *

（1 Department of Biochemistry and Molecular Biology，Hainan Medical College，Haikou Hainan 571199； 2 Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology/Analysis & Testing Center，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences； 3 College of Agronomy，Hainan University）

AbstractMimulus gutatus miRNA was predicted based on GSS Sequences by miRtour，whereas miRNA-targeted mRNAs were predicted by psrobot. 50 unique mature miRNA sequences were found in which the uracil nucleotide is dominant in the first position of 5′mature miRNAs. 64 mRNAs were regulated by miRNA in which 15 targets was transcription factors，21 targets was enzymes.

Key wordsMimulus gutatus；miRNA；bioinformatics；GSS sequence

miRNA是一類長度為19~24 bp的內(nèi)源性小RNA分子，其主要通過與靶基因結合后在轉(zhuǎn)錄后水平進行基因表達調(diào)控。由中介子（Mediator）將RNA聚合酶Ⅱ招募到miRNA基因的啟動子后轉(zhuǎn)錄miRNA初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（primary miRNA，pri-miRNA）[1]，然后經(jīng)歷與mRNA相同的加帽、加尾和拼接過程后，形成獨特的莖環(huán)結構[2]，植物中再在DCL蛋白的作用下加工為miRNA前體序列（precursor-miRNA，pre-miRNA）。miRNA前體序列再經(jīng)過一些列復雜過程加工為成熟的miRNA序列后，與Argonaute蛋白結合形成RISC復合體后與靶基因結合在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮調(diào)控作用。由于miRNA參與了植物器官的發(fā)育、代謝的調(diào)節(jié)和抗逆反應等一系列復雜生物學過程[3]，因而近年來miRNA被廣泛應用于植物的遺傳品質(zhì)改良工作。

而猴面花（Mimulus gutatus）為玄參科溝酸漿屬草本植物，原產(chǎn)于北美西部，現(xiàn)在世界范圍內(nèi)被廣泛栽培。猴面花可用于公園、小區(qū)的花壇、花臺、花境栽培觀賞，也是庭院及居室栽培的優(yōu)良材料[4]。此外猴面花還是被廣泛應用于生態(tài)和進化遺傳學研究領域的模式生物[5]。本研究擬應用miRtour在線分析工具（http：//bio2server.bioinfo. uni-plovdiv.bg/miRTour/）[6]對猴面花的GSS序列進行分析，識別其miRNA基因和靶基因，為進一步開展猴面花遺傳品質(zhì)改良工作和探討猴面花獨特的生態(tài)特點奠定理論基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

從美國國家生物技術信息中心（National Center for Biote-chnology Information，NCBI）的網(wǎng)站（www.ncbi.nlm.nih.gov）的GSS數(shù)據(jù)庫中下載134 919條猴面花序列，另外分別從rfam網(wǎng)站（http：//rfam.sanger.ac.uk/）和pfam網(wǎng)站（http：//pfam.sanger.ac.uk/）下載非編碼RNA數(shù)據(jù)庫和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫。

1.2研究方法

將猴面花GSS序列分批遞交到miRtour網(wǎng)站上傳后參數(shù)設置如下：與已知miRNA序列能夠比對的最小數(shù)量（Minimum number of known miRNAs to be aligned）設置為1，miRNA序列與其互補序列的不配對數(shù)（Maximum unpaired nt in miR/miR*）設置為6，其他參數(shù)默認。下載分析結果可以得到相應的miRNA序列、前體序列以及前體序列的最小自由能、最小自由能指數(shù)等相關參數(shù)。然后應用Blast-2.2.27+軟件中的blastn程序?qū)㈩A測到的miRNA前體序列與rfam數(shù)據(jù)庫進行比對，應用blastx程序與pfam數(shù)據(jù)庫進行比對，將evalue參數(shù)設置為1e-6，去除非miRNA序列，即可得到miRNA前體序列和相應的miRNA序列。將預測到的成熟猴面花miRNA序列以fasta格式上傳到psrobot網(wǎng)站（http：//omicslab.genetics.ac.cn/psRobot/index.php）[7]進行靶基因預測，參數(shù)選擇嚴格模式，同時將分值（score）設置為2.5。應用bioedit統(tǒng)計miRNA及其前體的序列長度，然后統(tǒng)計miRNA序列每個位點的堿基組成，對其堿基偏倚進行分析。

2結果與分析

2.1miRNA預測

134 919條猴面花GSS序列經(jīng)過miRtour分析后共發(fā)現(xiàn)72條具有莖環(huán)結構的序列，與rfam和pfam數(shù)據(jù)庫比對后發(fā)現(xiàn)2條蛋白質(zhì)序列，去除重復預測miRNA序列后，共預測到50條不同的猴面花miRNA成熟序列（表1）。這50條猴面花miRNA序列隸屬于35個不同的miRNA家族，其中成員最多的為miR2607家族，有6個成員。所有前體序列的最小自由能都為負值，最高的為mgu-miR1534，其自由能為-32.64 kJ/mol。前體序列的最小自由能指數(shù)為0.70～1.13，GC含量為12.22%～72.51%。

2.2miRNA和前體的堿基組成特征

猴面花miRNA長度為18～23 nt，其中35個miRNA長度為21 nt。miRNA序列中嘌呤與嘧啶的比值為1.00∶0.97，其詳細堿基組成A∶G∶C∶U為1.00∶0.89∶0.67∶1.17，胞嘧啶比例明顯偏低。同時發(fā)現(xiàn)在miRNA 5′端第1~2堿基尿嘧啶的出現(xiàn)頻率都最高，分別為42%和60%。而腺嘌呤則在第15堿基、鳥嘌呤在第12和第14堿基、胞嘧啶在第4和第20堿基出現(xiàn)頻率最高。miRNA前體長度為90～223 nt，平均長度為179 nt，嘌呤與嘧啶的比值為1.00∶0.99，堿基組成A∶G∶C∶U為1.00∶0.66∶0.51∶1.13，鳥嘌呤和胞嘧啶比例偏低。

2.3miRNA靶基因預測

50個猴面花 miRNA中有25個預測到了靶基因，靶基因數(shù)目最多的為mgu-miR156，發(fā)現(xiàn)有10條編碼序列受其調(diào)控（表2）。同時發(fā)現(xiàn)共64條編碼序列受到猴面花miRNA的調(diào)控，大部分基因都受單一miRNA的調(diào)控。但發(fā)現(xiàn)編碼胡蘿卜素順反異構酶的mgv1a008474m 序列受mgu-miR2607a和mgu-miR2607b調(diào)控；編碼PHO2蛋白的mgv1a001292m同時受mgu-miR399a和mgu-miR399b調(diào)控，而且發(fā)現(xiàn)mgu-miR399b與mgv1a001292m有3個結合位點分別為637～657、700～720、757～777 nt。靶基因中有15個編碼轉(zhuǎn)錄因子，主要有SPL轉(zhuǎn)錄因子、AP2蛋白、核因子、bHLH DNA結合蛋白和鋅指蛋白等；此外還有21條靶基因序列編碼酶。

3結論與討論

GSS序列，又稱基因組勘測序列是基因組DNA克隆的一次性部分測序序列，包括隨機的基因組勘測序列、cosmid/BAC/YAC末端序列、通過Exon trapped獲得的基因組序列、通過Alu PCR 獲得的序列以及轉(zhuǎn)座子標記（transposon-tagged）序列等[8]，也被廣泛地應用于植物miRNA的預測分析。應用GSS序列識別植物miRNA的數(shù)量與其GSS序列數(shù)量密切相關，Zhang等[9]在棉花中發(fā)現(xiàn)30條miRNA序列，Xie等[10]在歐洲油菜（Brassica napus）8條miRNA序列，羅曉燕等[8]在核果類作物中發(fā)現(xiàn)9條miRNA序列，杜江峰等[11]在高粱中發(fā)現(xiàn)17條，而李婧等[12]在玉米中僅發(fā)現(xiàn)3條。但Wang等[13]對甘藍（Brassica oleracea）的680 894條GSS序列研究中發(fā)現(xiàn)152個miRNA。而本研究中對猴面花134 919條GSS序列研究中共發(fā)現(xiàn)50個miRNA，其識別效率與其他基于GSS的研究相差不大。同時在本研究中發(fā)現(xiàn)miRNA 5′端第1堿基尿嘧啶的出現(xiàn)頻率明顯高于其他堿基，這與在擬南芥和水稻的研究一致[14]，目前認為miRNA5′端堿基對于其與選擇不同Argonaute蛋白結合形成RISC復合物是至關重要的[15]。然而整體來講，本研究中識別的猴面花miRNA數(shù)量與其真實的miRNA基因數(shù)量還有很大的差距，Bartel等[16]認為每個物種的miRNA數(shù)量應該達到其基因數(shù)量的1%，而事實上mirbase數(shù)據(jù)庫中有些植物的miRNA數(shù)量已經(jīng)達到700余條。因而猴面花的miRNA研究在未來還有待于基于全基因組范圍內(nèi)的生物信息學分析或通過小RNA測序等相關實驗技術進行識別。

猴面花在北美西海岸地區(qū)為夏末季節(jié)開花的多年生植物，而距據(jù)此不遠的內(nèi)陸地區(qū)卻為春季開花的一年生植物，研究表明這主要是由于猴面花對干旱的內(nèi)陸地區(qū)和潮濕高鹽的沿海地區(qū)適應的結果[17]。Jorgensen等[18]認為SPL轉(zhuǎn)錄因子家族可能通過調(diào)控開花時間基因的表達決定物種是多年生植物還是一年生植物，同時近來在植物中發(fā)現(xiàn)miRNA156家族通過調(diào)控SPL轉(zhuǎn)錄因子家族決定植物發(fā)育時相的轉(zhuǎn)變。而在本研究中也發(fā)現(xiàn)miRNA156的靶基因為SPL轉(zhuǎn)錄因子，同時還發(fā)現(xiàn)mgu-miR1862的靶基因為葉綠體干旱誘導蛋白，但這2個miRNA是否與決定猴面花為多年生植物還是一年生植物直接相關還有待于進一步研究。

4參考文獻

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[12] 李婧，熊莉麗，胡久梅，等.基于EST和GSS序列的玉米未知微RNA（下轉(zhuǎn)第351頁）

（上接第347頁）

的數(shù)據(jù)挖掘[J].生物技術通報，2011（12）：108-112.

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[18] JORGENSEN S A，PRESTON J C.Differential SPL gene expression patterns reveal candidate genes underlying flowering time and architec-tural differences in Mimulus and Arabidopsis[J].Mol Phylogenet Evol，2014（73）：129-139.

2.3miRNA靶基因預測

50個猴面花 miRNA中有25個預測到了靶基因，靶基因數(shù)目最多的為mgu-miR156，發(fā)現(xiàn)有10條編碼序列受其調(diào)控（表2）。同時發(fā)現(xiàn)共64條編碼序列受到猴面花miRNA的調(diào)控，大部分基因都受單一miRNA的調(diào)控。但發(fā)現(xiàn)編碼胡蘿卜素順反異構酶的mgv1a008474m 序列受mgu-miR2607a和mgu-miR2607b調(diào)控；編碼PHO2蛋白的mgv1a001292m同時受mgu-miR399a和mgu-miR399b調(diào)控，而且發(fā)現(xiàn)mgu-miR399b與mgv1a001292m有3個結合位點分別為637～657、700～720、757～777 nt。靶基因中有15個編碼轉(zhuǎn)錄因子，主要有SPL轉(zhuǎn)錄因子、AP2蛋白、核因子、bHLH DNA結合蛋白和鋅指蛋白等；此外還有21條靶基因序列編碼酶。

3結論與討論

GSS序列，又稱基因組勘測序列是基因組DNA克隆的一次性部分測序序列，包括隨機的基因組勘測序列、cosmid/BAC/YAC末端序列、通過Exon trapped獲得的基因組序列、通過Alu PCR 獲得的序列以及轉(zhuǎn)座子標記（transposon-tagged）序列等[8]，也被廣泛地應用于植物miRNA的預測分析。應用GSS序列識別植物miRNA的數(shù)量與其GSS序列數(shù)量密切相關，Zhang等[9]在棉花中發(fā)現(xiàn)30條miRNA序列，Xie等[10]在歐洲油菜（Brassica napus）8條miRNA序列，羅曉燕等[8]在核果類作物中發(fā)現(xiàn)9條miRNA序列，杜江峰等[11]在高粱中發(fā)現(xiàn)17條，而李婧等[12]在玉米中僅發(fā)現(xiàn)3條。但Wang等[13]對甘藍（Brassica oleracea）的680 894條GSS序列研究中發(fā)現(xiàn)152個miRNA。而本研究中對猴面花134 919條GSS序列研究中共發(fā)現(xiàn)50個miRNA，其識別效率與其他基于GSS的研究相差不大。同時在本研究中發(fā)現(xiàn)miRNA 5′端第1堿基尿嘧啶的出現(xiàn)頻率明顯高于其他堿基，這與在擬南芥和水稻的研究一致[14]，目前認為miRNA5′端堿基對于其與選擇不同Argonaute蛋白結合形成RISC復合物是至關重要的[15]。然而整體來講，本研究中識別的猴面花miRNA數(shù)量與其真實的miRNA基因數(shù)量還有很大的差距，Bartel等[16]認為每個物種的miRNA數(shù)量應該達到其基因數(shù)量的1%，而事實上mirbase數(shù)據(jù)庫中有些植物的miRNA數(shù)量已經(jīng)達到700余條。因而猴面花的miRNA研究在未來還有待于基于全基因組范圍內(nèi)的生物信息學分析或通過小RNA測序等相關實驗技術進行識別。

猴面花在北美西海岸地區(qū)為夏末季節(jié)開花的多年生植物，而距據(jù)此不遠的內(nèi)陸地區(qū)卻為春季開花的一年生植物，研究表明這主要是由于猴面花對干旱的內(nèi)陸地區(qū)和潮濕高鹽的沿海地區(qū)適應的結果[17]。Jorgensen等[18]認為SPL轉(zhuǎn)錄因子家族可能通過調(diào)控開花時間基因的表達決定物種是多年生植物還是一年生植物，同時近來在植物中發(fā)現(xiàn)miRNA156家族通過調(diào)控SPL轉(zhuǎn)錄因子家族決定植物發(fā)育時相的轉(zhuǎn)變。而在本研究中也發(fā)現(xiàn)miRNA156的靶基因為SPL轉(zhuǎn)錄因子，同時還發(fā)現(xiàn)mgu-miR1862的靶基因為葉綠體干旱誘導蛋白，但這2個miRNA是否與決定猴面花為多年生植物還是一年生植物直接相關還有待于進一步研究。

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[12] 李婧，熊莉麗，胡久梅，等.基于EST和GSS序列的玉米未知微RNA（下轉(zhuǎn)第351頁）

（上接第347頁）

的數(shù)據(jù)挖掘[J].生物技術通報，2011（12）：108-112.

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2.3miRNA靶基因預測

50個猴面花 miRNA中有25個預測到了靶基因，靶基因數(shù)目最多的為mgu-miR156，發(fā)現(xiàn)有10條編碼序列受其調(diào)控（表2）。同時發(fā)現(xiàn)共64條編碼序列受到猴面花miRNA的調(diào)控，大部分基因都受單一miRNA的調(diào)控。但發(fā)現(xiàn)編碼胡蘿卜素順反異構酶的mgv1a008474m 序列受mgu-miR2607a和mgu-miR2607b調(diào)控；編碼PHO2蛋白的mgv1a001292m同時受mgu-miR399a和mgu-miR399b調(diào)控，而且發(fā)現(xiàn)mgu-miR399b與mgv1a001292m有3個結合位點分別為637～657、700～720、757～777 nt。靶基因中有15個編碼轉(zhuǎn)錄因子，主要有SPL轉(zhuǎn)錄因子、AP2蛋白、核因子、bHLH DNA結合蛋白和鋅指蛋白等；此外還有21條靶基因序列編碼酶。

3結論與討論

GSS序列，又稱基因組勘測序列是基因組DNA克隆的一次性部分測序序列，包括隨機的基因組勘測序列、cosmid/BAC/YAC末端序列、通過Exon trapped獲得的基因組序列、通過Alu PCR 獲得的序列以及轉(zhuǎn)座子標記（transposon-tagged）序列等[8]，也被廣泛地應用于植物miRNA的預測分析。應用GSS序列識別植物miRNA的數(shù)量與其GSS序列數(shù)量密切相關，Zhang等[9]在棉花中發(fā)現(xiàn)30條miRNA序列，Xie等[10]在歐洲油菜（Brassica napus）8條miRNA序列，羅曉燕等[8]在核果類作物中發(fā)現(xiàn)9條miRNA序列，杜江峰等[11]在高粱中發(fā)現(xiàn)17條，而李婧等[12]在玉米中僅發(fā)現(xiàn)3條。但Wang等[13]對甘藍（Brassica oleracea）的680 894條GSS序列研究中發(fā)現(xiàn)152個miRNA。而本研究中對猴面花134 919條GSS序列研究中共發(fā)現(xiàn)50個miRNA，其識別效率與其他基于GSS的研究相差不大。同時在本研究中發(fā)現(xiàn)miRNA 5′端第1堿基尿嘧啶的出現(xiàn)頻率明顯高于其他堿基，這與在擬南芥和水稻的研究一致[14]，目前認為miRNA5′端堿基對于其與選擇不同Argonaute蛋白結合形成RISC復合物是至關重要的[15]。然而整體來講，本研究中識別的猴面花miRNA數(shù)量與其真實的miRNA基因數(shù)量還有很大的差距，Bartel等[16]認為每個物種的miRNA數(shù)量應該達到其基因數(shù)量的1%，而事實上mirbase數(shù)據(jù)庫中有些植物的miRNA數(shù)量已經(jīng)達到700余條。因而猴面花的miRNA研究在未來還有待于基于全基因組范圍內(nèi)的生物信息學分析或通過小RNA測序等相關實驗技術進行識別。

猴面花在北美西海岸地區(qū)為夏末季節(jié)開花的多年生植物，而距據(jù)此不遠的內(nèi)陸地區(qū)卻為春季開花的一年生植物，研究表明這主要是由于猴面花對干旱的內(nèi)陸地區(qū)和潮濕高鹽的沿海地區(qū)適應的結果[17]。Jorgensen等[18]認為SPL轉(zhuǎn)錄因子家族可能通過調(diào)控開花時間基因的表達決定物種是多年生植物還是一年生植物，同時近來在植物中發(fā)現(xiàn)miRNA156家族通過調(diào)控SPL轉(zhuǎn)錄因子家族決定植物發(fā)育時相的轉(zhuǎn)變。而在本研究中也發(fā)現(xiàn)miRNA156的靶基因為SPL轉(zhuǎn)錄因子，同時還發(fā)現(xiàn)mgu-miR1862的靶基因為葉綠體干旱誘導蛋白，但這2個miRNA是否與決定猴面花為多年生植物還是一年生植物直接相關還有待于進一步研究。

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