陳炯+屠麗紅+陳艷新+秦勝營

[摘要]

目的：通過應(yīng)用微流體芯片（lab-on-chip）技術(shù)檢測食源性致病菌，包括霍亂弧菌、沙門氏菌、副溶血性弧菌、志賀氏菌等細菌的靈敏度和精確度，從而建立突發(fā)公共衛(wèi)生事件現(xiàn)場實驗室的解決方案。方法：分別采用Lab-on-chip平臺食源性病原體微流檢測芯片和熒光PCR方法對食源性病原菌樣本進行檢測，對比分析食源性微流芯片檢測方法的特異性、敏感度、準確性和重復(fù)性等。根據(jù)Lab-on-chip說明書以及熒光定量PCP試劑盒操作說明進行操作。結(jié)果：Lab-on-chip方法的霍亂弧菌、沙門氏菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌檢出限為：5x103 to 103 DNA Copies/ml。特異性、準確性和重復(fù)性都獲得了良好的結(jié)果。 結(jié)論：Lab-on-chip方法具有快速、便捷、高效、準確等優(yōu)點，可以在突發(fā)公共衛(wèi)生事件中作為良好的檢測工具和方法。

[關(guān)鍵詞] Lab-on-chip微流體芯片；食源性致病菌；檢測方法

* “十二五”重大傳染病防治國家重大科技專項：致病菌新型分子血清型分型系統(tǒng)的建立（No. 2013ZX10004216-001-004）

[作者簡介] 陳炯（1978- ），男，主管技師，醫(yī)學(xué)學(xué)士，主要從事微生物檢驗研究工作。單位：上海市疾病預(yù)防控制中心（地址：上海市長寧區(qū)中山西路1380號，郵編200336）聯(lián)系電話：13817529058，郵箱：jchen_4@scdc.sh.cn

[通訊作者] 陳敏 mchen@scdc.sh.cn 聯(lián)系電話：13671927931

Lab-on-chip for the detection of food borne pathogenic bacteria

Chen Jiong1 , Tu Lihong1, Chen Yanxin1, Qin Shengying2

(1. Shanghai Municipal Center for Disease Control and Prevention, Shanghai 200336, China;

2. The Bio-X Institutes of Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200336, China)

Author for correspondence: Chen Min

[Abstract]Objective：To set up an onsite protocol for abrupt emergencies of public health, both the sensitivity and accuracy of the lab-on-chip forthe detection of food borne pathogenic bacterium including Vibrio cholera, Salmonella, Vibrio parahaemolyticus and Shigellaare exanimated. Methods: Comparing the results from the chips and fluorescence quantitative PCR, the specificity, sensitivity, accuracy and repeatability of the Lab-on-chip are analyzed. Result: Acceptable specificity, accuracy and repeatability of the chips are achieved, the limitation of the chips for the Vibrio cholera, Salmonella, Vibrio parahaemolyticus and Shigella is 5x103 to 103 DNA Copies/ml. Conclusion: Lab-on-chip is considered as a fast, convenient, efficient tool with acceptable accuracy for public health emergencies.

[Key words] Lab-on-chip, Food borne pathogen, detection method

食源性致病菌引起的感染性腹瀉是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率僅次于心血管疾病的第二大疾病。由于全球性食品貿(mào)易的快速增長，目前微生物污染所引起的食源性疾病作為一個嚴重的公共衛(wèi)生問題已引起人們的廣泛關(guān)注和深入研究，食源性疾病對人類健康構(gòu)成了巨大的威脅，食品安全已成為世界性公共衛(wèi)生問題[1]。無論在發(fā)達國家或發(fā)展中國家食源性細菌污染都是影響食品安全的最主要原因。近幾年來全球許多國家多次爆發(fā)由上述致病菌所致的食源性疾病。特別是2012年在歐洲發(fā)生的毒黃瓜事件受到了全球的廣泛關(guān)注。以20世紀90年代后我國法定報告?zhèn)魅静〉陌l(fā)病數(shù)來看，由于食源性致病菌導(dǎo)致的疾病發(fā)病率一直名列前茅[2]?；魜y弧菌、沙門氏菌、志賀氏菌、痢疾桿菌、副溶血性弧菌、蠟樣芽孢桿菌、彎曲桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、阪崎腸桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特菌和出血性大腸桿菌O157等十八種病原體是引起食源性感染的重要病原體，常常在特定范圍內(nèi)引起大規(guī)模暴發(fā)流行。

如何快速、準確地檢測并確定病原體是實驗室能力建設(shè)和技術(shù)保障的核心內(nèi)容。長期以來，在食源性致病細菌檢測方面以培養(yǎng)方法為主，目前也有PCR相關(guān)方法進行檢測，但培養(yǎng)方法不僅操作繁瑣、耗時，而且容易漏檢[3]。對于PCR方法而言，其檢測通量有限，對實驗室的分區(qū)要求高。同時這些方法的檢測周期長，如細菌的檢測方法中傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法（GB法）、SN方法，以抗體為基礎(chǔ)的免疫檢測方法等一般都需要6個小時以上的檢測時間[4]。作為應(yīng)對公共衛(wèi)生突發(fā)事件的疾病預(yù)防機構(gòu)在疫情處置方面有其特殊性，不僅要求對病原體“檢得出”，還要求能夠“檢得準、檢得快”，要擁有“一錘定音”的能力才滿足現(xiàn)場快速處置疫情的需要。

筆者旨在通過研究Lab-on-chip快速檢測方法對重要食源性病原體及危害因子的檢測應(yīng)用。此項研究采用的四個菌種全面考慮了這些菌株在疾病預(yù)防控制工作中的特殊地位?；魜y弧菌屬于甲類傳染病，是突發(fā)集團腹瀉等公共衛(wèi)生事件中必檢的工作；志賀氏菌為乙類傳染病中最受關(guān)注的一種；沙門氏菌和副溶血性弧菌都屬于丙類傳染病，其中沙門氏菌(非傷寒類)為國際疾病預(yù)防機構(gòu)最為關(guān)注的傳染性致病菌，而副溶血性弧菌是包括上海在內(nèi)的沿海城市中最為常見的腹瀉致病菌。Lab-on-chip方法不僅能夠拓展病原體檢測的方法學(xué)研究，加強對食品安全的管理，而且大大縮短了檢測時間，為現(xiàn)場處置及時提供準確依據(jù)，并可以實現(xiàn)對國內(nèi)外法律法規(guī)重點管控的食品進行食源性致病菌現(xiàn)場快速檢測與鑒定，填補了相關(guān)檢測空白。

1 材料

1.1試驗菌株

霍亂弧菌（n=30）、沙門氏菌（n=36）、志賀氏菌（n=34）、副溶血性弧菌（n=31），空腸彎曲菌（n=8）、金黃色葡萄球菌（n=7）、大腸桿菌EHEC（n=7）、單核細胞李斯特菌（n=8）以上菌種均來源于上海市疾病預(yù)防控制中心實驗室保藏。

1.2 模擬樣品

模擬樣品采用奶粉中加入包括霍亂弧菌、沙門氏菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌在內(nèi)的多種菌株，同時加入其它食源性致病菌（包括空腸彎曲菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌EHEC、單核細胞李斯特菌）用于準確性和特異性檢測（所有菌株均稀釋至104 DNA Copies/ml）。

1.3 實際樣品

對于從市場中購買的32份魚類海產(chǎn)品進行副溶血性弧菌的檢測。

1.4 試劑盒

Lab-on-chip：細菌基因組DNA提取試劑盒(QIAGEN，QIAprep Spin Miniprep Kit)；芯片雜交液和洗脫液(上海佰真生物有限公司)；探針和引物由新加坡威特實驗室合成。

熒光PCR：核酸抽提液、核酸熒光PCR檢測混合液、Taq + UNG酶由上海之江生物科技股份有限公司提供。

1.5儀器及耗材

生物芯片 (上海佰真生物有限公司)；溫度控制PCR擴增-雜交系統(tǒng)(上海佰真生物有限公司)；芯片閱讀儀(上海佰真生物有限公司)；實時熒光PCR儀（Bio rad CFX96）。

2方法

2.1 引物及探針的設(shè)計與合成

以在細菌分類鑒定學(xué)上具有重要意義的特異性基因片段作為芯片檢測的靶基因，霍亂弧菌和副溶血性弧菌采用Tu基因，沙門氏菌采用Muts毒力基因，志賀氏菌采用Reg-O-Ag基因。為了使探針分子在芯片上伸展開來，利于靶標探針的雜交，合成時在每個探針的5加上1個氨基和15個T。引物和探針由新加坡威特實驗室合成，正鏈引物用TAMRA熒光標記。

2.2芯片的制備

采用醛基修飾的基片，利用合成好的探針點制到芯片上，氨基修飾的寡聚核苷酸探針和芯片表面的醛基相連從而固定到芯片上。在點樣時同時設(shè)置芯片固定陽性對照、試驗陽性及陰性對照。（見圖1）

圖1 Lab on chip芯片點陣分布圖

2.3 DNA抽提

利用QIAGEN試劑盒，對檢測樣品進行DNA抽提。

2.4 Lab-on-chip檢測

PCR反應(yīng)：稀釋PCR control；混合PCR 反應(yīng)液(A,B兩管)，12.5ul/管；將反應(yīng)液加入芯片，每個加樣孔11.5ul；將芯片放入反應(yīng)室內(nèi)進行反應(yīng)；雜交反應(yīng)：雜交反應(yīng)液的配制，將870ul雜交緩沖液與30ul雜交探針混合均勻；將雜交反應(yīng)液加入芯片，每個加樣孔14.5ul，將芯片放入反應(yīng)室內(nèi)進行反應(yīng)；清洗：洗液，3000r/m 離心2min兩次；結(jié)果測定：掃描芯片上的條碼，將芯片插入芯片閱讀儀中進行結(jié)果判讀。

2.5熒光PCR檢測[5]

試劑配制加樣：36ul樣品核酸熒光PCR檢測混合液，4ul（Taq酶+UNG）模板；PCR擴增：37℃×2min、94℃×2min；再按93℃×15sec - 60℃×60sec，循環(huán)40次；單點熒光檢測在60℃。反應(yīng)體系為40ul。

2.6 方法的特異性、準確性、檢出限和重復(fù)性檢測

2.6.1 特異性檢測

選取四種目標菌分離株各30株和其他不同菌株之間進行特異性檢測。按照優(yōu)化好的條件進行多重PCR擴增，然后將PCR產(chǎn)物與芯片雜交。

2.6.2 準確性檢測

同時進行熒光PCR檢測，比較方法的準確性。每組試驗重復(fù)3次。

2.6.3 檢出限測定

取四種目標菌的24h增菌培養(yǎng)物，制成DNA模板后，分別以10倍梯度稀釋至103-102 DNA Copies/ml，首先按照優(yōu)化好的條件進行多重PCR擴增，然后將PCR產(chǎn)物與芯片雜交。以3次試驗均檢出細菌的濃度作為靈敏度。

2.6.4 重復(fù)性檢測

對同一種目標菌株進行重復(fù)3次的試驗，比較其重復(fù)性。

2.7 模擬樣品檢測一致性比對

用Lab-on-chip方法和熒光PCR的方法同時對加入包括霍亂弧菌、沙門氏菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌在內(nèi)的多種菌株，并加入包括空腸彎曲菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌EHEC、單核細胞李斯特菌等其它食源性致病菌的奶粉樣品進行檢測（所有菌株均稀釋至104 DNA Copies/ml）。

2.8 實際樣品檢測

同時用Lab-on-chip方法和熒光PCR的方法對于從市場中購買的32份魚類海產(chǎn)品進行副溶血性弧菌的檢測。

3 結(jié)果

3.1 芯片檢測結(jié)果圖示見圖2：

圖2 芯片檢測結(jié)果圖例

3.2 芯片特異性結(jié)果：

選取霍亂弧菌、沙門氏菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌分離株各30株、空腸彎曲菌8株、金黃色葡萄球菌7株、大腸桿菌EHEC7株、單核細胞李斯特菌8株，進行單盲設(shè)計后檢測，霍亂弧菌、沙門氏菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌的特異性分別達到100%、100%、96.7%、100%。（見表1-4）表明制備的芯片對目標菌具有較好的特異性。

表1Lab-on-chip方法檢測霍亂弧菌結(jié)果準確性和特異性

霍亂弧菌 Lab-on-chip方法 準確性（%） 特異性（%）

檢出陽性 檢出陰性 合計

陽性 30 0 30 100 -

陰性 0 30 30 - 100

合計 30 30 60

表2Lab-on-chip方法檢測沙門氏菌結(jié)果準確性和特異性

沙門氏菌 Lab-on-chip方法 準確性（%） 特異性（%）

檢出陽性 檢出陰性 合計

陽性 29 1 30 96.7 -

陰性 0 30 30 - 100

合計 29 31 60

表3Lab-on-chip方法檢測志賀氏菌結(jié)果準確性和特異性

志賀氏菌 Lab-on-chip方法 準確性（%） 特異性（%）

檢出陽性 檢出陰性 合計

陽性 28 2 30 93.3 -

陰性 1 29 30 - 96.7

合計 29 31 60

表4Lab-on-chip方法檢測副溶血性弧菌結(jié)果準確性和特異性

副溶血性弧菌 Lab-on-chip方法 準確性（%） 特異性（%）

檢出陽性 檢出陰性 合計

陽性 29 1 30 96.7 -

陰性 0 30 30 - 100

合計 29 31 60

3.3 芯片準確性評價

霍亂弧菌、沙門氏菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌的準確性分別達到100%、96.7%、93.3%、96.7%。（見表1-4）

3.4 芯片檢出限測定結(jié)果：

lab-on-chip方法對霍亂弧菌、沙門氏菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌的檢測檢出限為 5x103 to 103 DNA Copies/ml，較熒光PCR方法的檢測檢出限為103 DNA Copies/ml。兩種方法的靈敏度相當[6]。

3.5芯片重復(fù)性檢測結(jié)果：

對每個菌株進行的3次重復(fù)檢測試驗，結(jié)果均一致。

3.6模擬樣品檢測方法一致性比對：

選取48個加標食源性病原菌模擬樣本進行熒光PCR和Lab - on - chip平臺進行檢測的結(jié)果分析和統(tǒng)計見表5-8。

表5Lab-on-chip方法與熒光PCR法檢測霍亂弧菌結(jié)果一致性分析

熒光PCR法 一致率(%)

陽性 陰性 合計 陽性 陰性

Lab-on-chip方法 陽性 30 0 30 100 -

陰性 1 17 18 - 94

合計 31 17 48 97.9

表6Lab-on-chip方法與熒光PCR法檢測沙門氏菌結(jié)果一致性分析

熒光PCR法 一致率(%)

陽性 陰性 合計 陽性 陰性

Lab-on-chip方法 陽性 35 1 36 97 -

陰性 0 12 12 - 100

合計 35 13 48 97.9

表7Lab-on-chip方法與熒光PCR法檢測志賀氏菌結(jié)果一致性分析

熒光PCR法 一致率(%)

陽性 陰性 合計 陽性 陰性

Lab-on-chip方法 陽性 33 1 34 97 -

陰性 1 13 14 - 93

合計 34 14 48 95.8

表8Lab-on-chip方法與熒光PCR法檢測副溶血性弧菌結(jié)果一致性分析

熒光PCR法 一致率(%)

陽性 陰性 合計 陽性 陰性

Lab-on-chip方法 陽性 31 0 31 100 -

陰性 1 16 17 - 94

合計 32 16 48 97.9

3.7 Lab-on-chip平臺在實際樣品中檢測副溶血性弧菌的結(jié)果

使用Lab-on-chip平臺和熒光PCR的方法對實際樣品（魚類海產(chǎn)品）中的副溶血性弧菌進行檢測。檢出率情況見表9，檢測結(jié)果一致性情況見表10。

表9副溶血性弧菌檢出率

項目 檢測數(shù) 熒光PCR法 Lab-on-chip方法

檢出數(shù) 檢出率% 檢出數(shù) 檢出率%

海產(chǎn)品 32 6 18.7 5 15.6

表10實際樣品副溶血性弧菌檢測結(jié)果一致性分析

熒光PCR法 一致率(%)

陽性 陰性 合計 陽性 陰性

Lab-on-chip方法 陽性 5 0 5 100 -

陰性 1 26 27 - 96.3

合計 6 26 32 96.9

4 討論

Lab-on-chip平臺是20世紀末發(fā)展起來的一種微流體芯片診斷分析技術(shù)。Lab-on-chip方法是按照預(yù)定位置固定在固相載體上的大量核酸分子所組成的微陣列，在一定條件下載體上的核酸分子與樣品的序列互補的核酸片段雜交，同時對樣品中的核酸片段標記，在專用的芯片閱讀儀上進行檢測。該方法具有準確、快速、便捷、高效、信息量大，無需分離培養(yǎng)，不依賴于PCR實驗室平臺等特點，因而發(fā)展迅速。近年來，生物芯片在食品檢測中的應(yīng)用，包括對轉(zhuǎn)基因食品、食品微生物、食品營養(yǎng)成分、食品原料等領(lǐng)域檢測應(yīng)用越來越廣泛 [7]。

此項研究的試驗結(jié)果表明，這種方法設(shè)計的探針和引物具有良好的特異性。Lab-on-chip方法與傳統(tǒng)檢測方法相比只需要對樣品進行初增菌，無需分離培養(yǎng)，通過PCR擴增、雜交試驗，最快2h內(nèi)即可獲得檢測結(jié)果，從檢測時限方面大大縮短了現(xiàn)場檢驗的檢測周期。

該研究建立了檢測食品中常見四種致病微生物的Lab-on-chip方法，該方法與疾病預(yù)防系統(tǒng)目前使用的熒光PCR的檢驗標準方法結(jié)果有很好的一致性，芯片重復(fù)性檢測結(jié)果試驗顯示芯片的重復(fù)性良好，穩(wěn)定性較強；lab-on-chip方法的檢測靈敏度達到5x103 to 103 DNA Copies/ml與熒光PCR方法的檢測靈敏度103 DNA Copies/ml 相當，達到了應(yīng)急檢測實驗室的檢測要求，其精確度、準確性、重復(fù)性與經(jīng)典的熒光PCR相當，因此lab-on-chip方法檢測結(jié)果可靠。同時具有快速、便捷、高效、準確等優(yōu)點。

從實驗條件來看，Lab-on-chip方法無需依賴PCR實驗室分區(qū)平臺，具備了實驗場所可移動的優(yōu)點，可以作為突發(fā)公共衛(wèi)生應(yīng)急事件現(xiàn)場實驗室，能在突發(fā)公共衛(wèi)生應(yīng)急事件中大大提高檢測效率和準確性，有利于疾病預(yù)防機構(gòu)在突發(fā)公共衛(wèi)生事件中作為良好的現(xiàn)場檢測工具和方法。

從實驗結(jié)果顯示Lab-on-chip方法對于霍亂弧菌、沙門氏菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌四種食源性致病菌的特異性分別達到100%、100%、96.7%、100%表明該方法對于四種菌的特異性良好，其中志賀氏菌的特異性較低些，源于在特異性實驗中使用的大腸桿菌EHEC與志賀氏菌有一定的類似基因片段所致。今后可以在芯片引物設(shè)計上進一步加以優(yōu)化，從而使其特異性進一步提高。另一方面，在使用目前的芯片檢出志賀氏菌的同時提示有大腸桿菌EHEC存在的可能性。

由于研究時間和實際條件的限制，在實際樣品的檢測中只選擇了海產(chǎn)品中的副溶血性弧菌，對于lab-on-chip方法在其他菌種實際樣品中的檢出率情況還有待進一步的研究。

(致謝：本項研究得到了上海交通大學(xué)門Bio-X研究院和新加坡威特實驗室的支持與幫助，同時得到了本中心微生物檢測實驗室張曦主任的支持與幫助，微生物檢測實驗室的莊源等同志也參加了檢測工作，在此一并致謝!)

[參考文獻]

[1] Jeong-Yeol Yoon. Lab-on-a-Chip Pathogen Sensors for Food Safety[J]. Sensors 2012, 12, 10713-10741

[2] 蔡炯. 食源性疾病的現(xiàn)狀與防治(綜述)[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志，2011,15(9): 1150-1152．

[3] Yixian Wang. New Trends in Impedimetric Biosensors for the Detection of Food borne Pathogenic Bacteria [J].Sensors 2012, 12, 3449-3471

[4] GB4789-2010食品衛(wèi)生檢驗方法微生物學(xué)部分[S]．

[5] 楊俊超. 實時熒光定量PCR法與常規(guī)PCR法及細菌培養(yǎng)法檢測沙門菌的比較[J]. 浙江預(yù)防醫(yī)學(xué)2009，21（11）92-93

[6] 曾華. 實時熒光定量PCR法與基因芯片法檢測HPV的比較[J]. 分子診斷與治療雜志 2013,5（3）165-169

[7] 肖進文. 豬肉及其制品中幾種病原微生物芯片檢測方法的建立及應(yīng)用[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2010，38(18)：9478-9480，9607

陰性 0 12 12 - 100

合計 35 13 48 97.9

表7Lab-on-chip方法與熒光PCR法檢測志賀氏菌結(jié)果一致性分析

熒光PCR法 一致率(%)

陽性 陰性 合計 陽性 陰性

Lab-on-chip方法 陽性 33 1 34 97 -

陰性 1 13 14 - 93

合計 34 14 48 95.8

表8Lab-on-chip方法與熒光PCR法檢測副溶血性弧菌結(jié)果一致性分析

熒光PCR法 一致率(%)

陽性 陰性 合計 陽性 陰性

Lab-on-chip方法 陽性 31 0 31 100 -

陰性 1 16 17 - 94

合計 32 16 48 97.9

3.7 Lab-on-chip平臺在實際樣品中檢測副溶血性弧菌的結(jié)果

使用Lab-on-chip平臺和熒光PCR的方法對實際樣品（魚類海產(chǎn)品）中的副溶血性弧菌進行檢測。檢出率情況見表9，檢測結(jié)果一致性情況見表10。

表9副溶血性弧菌檢出率

項目 檢測數(shù) 熒光PCR法 Lab-on-chip方法

檢出數(shù) 檢出率% 檢出數(shù) 檢出率%

海產(chǎn)品 32 6 18.7 5 15.6

表10實際樣品副溶血性弧菌檢測結(jié)果一致性分析

熒光PCR法 一致率(%)

陽性 陰性 合計 陽性 陰性

Lab-on-chip方法 陽性 5 0 5 100 -

陰性 1 26 27 - 96.3

合計 6 26 32 96.9

4 討論

Lab-on-chip平臺是20世紀末發(fā)展起來的一種微流體芯片診斷分析技術(shù)。Lab-on-chip方法是按照預(yù)定位置固定在固相載體上的大量核酸分子所組成的微陣列，在一定條件下載體上的核酸分子與樣品的序列互補的核酸片段雜交，同時對樣品中的核酸片段標記，在專用的芯片閱讀儀上進行檢測。該方法具有準確、快速、便捷、高效、信息量大，無需分離培養(yǎng)，不依賴于PCR實驗室平臺等特點，因而發(fā)展迅速。近年來，生物芯片在食品檢測中的應(yīng)用，包括對轉(zhuǎn)基因食品、食品微生物、食品營養(yǎng)成分、食品原料等領(lǐng)域檢測應(yīng)用越來越廣泛 [7]。

此項研究的試驗結(jié)果表明，這種方法設(shè)計的探針和引物具有良好的特異性。Lab-on-chip方法與傳統(tǒng)檢測方法相比只需要對樣品進行初增菌，無需分離培養(yǎng)，通過PCR擴增、雜交試驗，最快2h內(nèi)即可獲得檢測結(jié)果，從檢測時限方面大大縮短了現(xiàn)場檢驗的檢測周期。

該研究建立了檢測食品中常見四種致病微生物的Lab-on-chip方法，該方法與疾病預(yù)防系統(tǒng)目前使用的熒光PCR的檢驗標準方法結(jié)果有很好的一致性，芯片重復(fù)性檢測結(jié)果試驗顯示芯片的重復(fù)性良好，穩(wěn)定性較強；lab-on-chip方法的檢測靈敏度達到5x103 to 103 DNA Copies/ml與熒光PCR方法的檢測靈敏度103 DNA Copies/ml 相當，達到了應(yīng)急檢測實驗室的檢測要求，其精確度、準確性、重復(fù)性與經(jīng)典的熒光PCR相當，因此lab-on-chip方法檢測結(jié)果可靠。同時具有快速、便捷、高效、準確等優(yōu)點。

從實驗條件來看，Lab-on-chip方法無需依賴PCR實驗室分區(qū)平臺，具備了實驗場所可移動的優(yōu)點，可以作為突發(fā)公共衛(wèi)生應(yīng)急事件現(xiàn)場實驗室，能在突發(fā)公共衛(wèi)生應(yīng)急事件中大大提高檢測效率和準確性，有利于疾病預(yù)防機構(gòu)在突發(fā)公共衛(wèi)生事件中作為良好的現(xiàn)場檢測工具和方法。

從實驗結(jié)果顯示Lab-on-chip方法對于霍亂弧菌、沙門氏菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌四種食源性致病菌的特異性分別達到100%、100%、96.7%、100%表明該方法對于四種菌的特異性良好，其中志賀氏菌的特異性較低些，源于在特異性實驗中使用的大腸桿菌EHEC與志賀氏菌有一定的類似基因片段所致。今后可以在芯片引物設(shè)計上進一步加以優(yōu)化，從而使其特異性進一步提高。另一方面，在使用目前的芯片檢出志賀氏菌的同時提示有大腸桿菌EHEC存在的可能性。

由于研究時間和實際條件的限制，在實際樣品的檢測中只選擇了海產(chǎn)品中的副溶血性弧菌，對于lab-on-chip方法在其他菌種實際樣品中的檢出率情況還有待進一步的研究。

(致謝：本項研究得到了上海交通大學(xué)門Bio-X研究院和新加坡威特實驗室的支持與幫助，同時得到了本中心微生物檢測實驗室張曦主任的支持與幫助，微生物檢測實驗室的莊源等同志也參加了檢測工作，在此一并致謝!)

[參考文獻]

[1] Jeong-Yeol Yoon. Lab-on-a-Chip Pathogen Sensors for Food Safety[J]. Sensors 2012, 12, 10713-10741

[2] 蔡炯. 食源性疾病的現(xiàn)狀與防治(綜述)[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志，2011,15(9): 1150-1152．

[3] Yixian Wang. New Trends in Impedimetric Biosensors for the Detection of Food borne Pathogenic Bacteria [J].Sensors 2012, 12, 3449-3471

[4] GB4789-2010食品衛(wèi)生檢驗方法微生物學(xué)部分[S]．

[5] 楊俊超. 實時熒光定量PCR法與常規(guī)PCR法及細菌培養(yǎng)法檢測沙門菌的比較[J]. 浙江預(yù)防醫(yī)學(xué)2009，21（11）92-93

[6] 曾華. 實時熒光定量PCR法與基因芯片法檢測HPV的比較[J]. 分子診斷與治療雜志 2013,5（3）165-169

[7] 肖進文. 豬肉及其制品中幾種病原微生物芯片檢測方法的建立及應(yīng)用[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2010，38(18)：9478-9480，9607

陰性 0 12 12 - 100

合計 35 13 48 97.9

表7Lab-on-chip方法與熒光PCR法檢測志賀氏菌結(jié)果一致性分析

熒光PCR法 一致率(%)

陽性 陰性 合計 陽性 陰性

Lab-on-chip方法 陽性 33 1 34 97 -

陰性 1 13 14 - 93

合計 34 14 48 95.8

表8Lab-on-chip方法與熒光PCR法檢測副溶血性弧菌結(jié)果一致性分析

熒光PCR法 一致率(%)

陽性 陰性 合計 陽性 陰性

Lab-on-chip方法 陽性 31 0 31 100 -

陰性 1 16 17 - 94

合計 32 16 48 97.9

3.7 Lab-on-chip平臺在實際樣品中檢測副溶血性弧菌的結(jié)果

使用Lab-on-chip平臺和熒光PCR的方法對實際樣品（魚類海產(chǎn)品）中的副溶血性弧菌進行檢測。檢出率情況見表9，檢測結(jié)果一致性情況見表10。

表9副溶血性弧菌檢出率

項目 檢測數(shù) 熒光PCR法 Lab-on-chip方法

檢出數(shù) 檢出率% 檢出數(shù) 檢出率%

海產(chǎn)品 32 6 18.7 5 15.6

表10實際樣品副溶血性弧菌檢測結(jié)果一致性分析

熒光PCR法 一致率(%)

陽性 陰性 合計 陽性 陰性

Lab-on-chip方法 陽性 5 0 5 100 -

陰性 1 26 27 - 96.3

合計 6 26 32 96.9

4 討論

Lab-on-chip平臺是20世紀末發(fā)展起來的一種微流體芯片診斷分析技術(shù)。Lab-on-chip方法是按照預(yù)定位置固定在固相載體上的大量核酸分子所組成的微陣列，在一定條件下載體上的核酸分子與樣品的序列互補的核酸片段雜交，同時對樣品中的核酸片段標記，在專用的芯片閱讀儀上進行檢測。該方法具有準確、快速、便捷、高效、信息量大，無需分離培養(yǎng)，不依賴于PCR實驗室平臺等特點，因而發(fā)展迅速。近年來，生物芯片在食品檢測中的應(yīng)用，包括對轉(zhuǎn)基因食品、食品微生物、食品營養(yǎng)成分、食品原料等領(lǐng)域檢測應(yīng)用越來越廣泛 [7]。

此項研究的試驗結(jié)果表明，這種方法設(shè)計的探針和引物具有良好的特異性。Lab-on-chip方法與傳統(tǒng)檢測方法相比只需要對樣品進行初增菌，無需分離培養(yǎng)，通過PCR擴增、雜交試驗，最快2h內(nèi)即可獲得檢測結(jié)果，從檢測時限方面大大縮短了現(xiàn)場檢驗的檢測周期。

該研究建立了檢測食品中常見四種致病微生物的Lab-on-chip方法，該方法與疾病預(yù)防系統(tǒng)目前使用的熒光PCR的檢驗標準方法結(jié)果有很好的一致性，芯片重復(fù)性檢測結(jié)果試驗顯示芯片的重復(fù)性良好，穩(wěn)定性較強；lab-on-chip方法的檢測靈敏度達到5x103 to 103 DNA Copies/ml與熒光PCR方法的檢測靈敏度103 DNA Copies/ml 相當，達到了應(yīng)急檢測實驗室的檢測要求，其精確度、準確性、重復(fù)性與經(jīng)典的熒光PCR相當，因此lab-on-chip方法檢測結(jié)果可靠。同時具有快速、便捷、高效、準確等優(yōu)點。

從實驗條件來看，Lab-on-chip方法無需依賴PCR實驗室分區(qū)平臺，具備了實驗場所可移動的優(yōu)點，可以作為突發(fā)公共衛(wèi)生應(yīng)急事件現(xiàn)場實驗室，能在突發(fā)公共衛(wèi)生應(yīng)急事件中大大提高檢測效率和準確性，有利于疾病預(yù)防機構(gòu)在突發(fā)公共衛(wèi)生事件中作為良好的現(xiàn)場檢測工具和方法。

從實驗結(jié)果顯示Lab-on-chip方法對于霍亂弧菌、沙門氏菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌四種食源性致病菌的特異性分別達到100%、100%、96.7%、100%表明該方法對于四種菌的特異性良好，其中志賀氏菌的特異性較低些，源于在特異性實驗中使用的大腸桿菌EHEC與志賀氏菌有一定的類似基因片段所致。今后可以在芯片引物設(shè)計上進一步加以優(yōu)化，從而使其特異性進一步提高。另一方面，在使用目前的芯片檢出志賀氏菌的同時提示有大腸桿菌EHEC存在的可能性。

由于研究時間和實際條件的限制，在實際樣品的檢測中只選擇了海產(chǎn)品中的副溶血性弧菌，對于lab-on-chip方法在其他菌種實際樣品中的檢出率情況還有待進一步的研究。

(致謝：本項研究得到了上海交通大學(xué)門Bio-X研究院和新加坡威特實驗室的支持與幫助，同時得到了本中心微生物檢測實驗室張曦主任的支持與幫助，微生物檢測實驗室的莊源等同志也參加了檢測工作，在此一并致謝!)

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[6] 曾華. 實時熒光定量PCR法與基因芯片法檢測HPV的比較[J]. 分子診斷與治療雜志 2013,5（3）165-169

[7] 肖進文. 豬肉及其制品中幾種病原微生物芯片檢測方法的建立及應(yīng)用[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2010，38(18)：9478-9480，9607