胡俊華，喻琴，楊艷果，王琦，盧光新

（1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院消化內(nèi)科，十堰 442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院兒科，十堰 442000）

胃癌（gastric carcinoma）是源自胃黏膜上皮的惡性腫瘤，是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率占消化道全部惡性腫瘤的首位。我國每年約有17萬人死于胃癌，幾乎為惡性腫瘤致死的全部患者的1/4。研究［1－4］表明，微小 RNA（miRNA）與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，多種miRNA在非惡性組織和胃癌組織中差異性表達(dá)。研究［5］發(fā)現(xiàn)，miR-503在胃癌細(xì)胞中可以抑制胃癌細(xì)胞的生長及細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化，但是關(guān)于miR-503在胃癌中作用機(jī)制的研究尚不明確。本實(shí)驗(yàn)利用實(shí)時(shí)定量PCR（Real-time PCR）證實(shí)了miR-503在胃癌中呈現(xiàn)低表達(dá)，可以抑制胃癌細(xì)胞生長，并且探索了miR-503對胃癌細(xì)胞生長和侵襲能力的影響機(jī)制及其發(fā)揮該作用的靶基因胰島素樣生長因子1受體（IGF-1R），為胃癌的治療提供了新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 病理樣本 10例胃癌及癌旁組織樣本，由天津腫瘤醫(yī)院病理科提供，并已通過病理學(xué)驗(yàn)證。

1.1.2 細(xì)胞 人胃癌細(xì)胞系 MGC-803和SGC－7901，購于上海中科院細(xì)胞庫。

1.1.3 主要試劑 胎牛血清購自Hyclone公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、1640細(xì)胞培養(yǎng)基及轉(zhuǎn)染用OPTI-MEM 均購自 Gibico公司；轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司（美國）；miR-503模擬物、模擬物對照、IGF-1R 干擾RNA、干擾RNA對照均購買于上海吉瑪技術(shù)制藥有限公司；反轉(zhuǎn)錄酶及Real-time PCR試劑盒購自Takara公司；體外細(xì)胞侵襲的Transwell小室購自Millipore公司；兔抗人IGF-1R、GAPDH（內(nèi)參）多克隆抗體以及羊抗兔二抗購自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人胃癌細(xì)胞系MGC-803使用90%DMEM高糖培養(yǎng)基＋10%胎牛血清培養(yǎng)；SGC-7901使用1640培養(yǎng)基＋10%胎牛血清培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 在轉(zhuǎn)染前16～20h，將貼壁的細(xì)胞消化下來，鋪在6孔板中。調(diào)整細(xì)胞密度，使其接種時(shí)細(xì)胞匯合度達(dá)到70%～80%，然后按照Lipofectamine TM 2000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.2.3 RNA提取和Real-time PCR 用Trizol提取組織樣品中的總RNA，然后使用Nano-Drop分光光度儀器進(jìn)行RNA濃度測定，瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的質(zhì)量。應(yīng)用特異miR-503的反轉(zhuǎn)錄引物，同時(shí)用U6作為內(nèi)參；對于大片段基因的檢測，用 Oligo（dT）作為通用引物，β-actin作為內(nèi)參。Real-time PCR總反應(yīng)體系20μL，其中包括cDNA和primer各1μL、SYBR熒光染料10μL、ddH2O 7 μL，反應(yīng)程序?yàn)?5℃，變性2min；95℃15s，60℃45s條件下40個(gè)循環(huán)。

1.2.4 Western blot檢測蛋白表達(dá)水平 將轉(zhuǎn)染48h處理后的細(xì)胞用PBS清洗，使用裂解液RIPA（50mM Tris-Cl pH 7.2，150mM NaCl，1%TritonX-100和0.1%SDS）裂解后提取蛋白，利用BCA方法測定蛋白濃度，最后用40μg蛋白上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測。100V2h分離，橫流轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶室溫封閉2h后，IGF-1R一抗（1∶1 000）4℃搖床孵育過夜，TBST清洗后使用HRP標(biāo)記的二抗（1∶10 000）室溫孵育2h，TBST清洗后應(yīng)用化學(xué)發(fā)光法曝光顯影。

1.2.5 平板細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染后的胃癌細(xì)胞按照200個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種到12孔板，使單個(gè)細(xì)胞分散均勻，并放置于37℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每隔2d換液，當(dāng)細(xì)胞形成肉眼可見（超過50個(gè)細(xì)胞）的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)，然后用PBS清洗細(xì)胞，利用5%結(jié)晶紫進(jìn)行染色并拍照計(jì)數(shù)。各細(xì)胞樣本接種3個(gè)復(fù)孔。

1.2.6 Transwell檢測細(xì)胞遷移能力 在轉(zhuǎn)染前16～20h，將貼壁的細(xì)胞消化下來，鋪在24孔板中。調(diào)整細(xì)胞密度，使其接種時(shí)細(xì)胞匯合度達(dá)到70%～80%，然后按照Lipofectamine TM 2000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24h后，將細(xì)胞接種在Matrigel覆蓋的Transwell上層小室內(nèi)（2×105細(xì)胞/孔），重懸在無血清培養(yǎng)基中，而小室底部是10%血清的培養(yǎng)基。待遷移24h后，將小室取出來，用甲醛和乙酸混合液固定15min，1×PBS清洗，用棉簽將小室內(nèi)未穿過的細(xì)胞擦掉，結(jié)晶紫染色后用1×PBS沖洗。隨機(jī)性選擇3個(gè)視野進(jìn)行拍照計(jì)數(shù)，計(jì)算平均每個(gè)視野下發(fā)生侵襲的細(xì)胞數(shù)目。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用Excel 2010對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Real-time PCR檢測人胃癌及癌旁組織中miR-503及IGF-1RmRNA的表達(dá)情況

選取10例臨床胃癌及其癌旁組織樣本提取RNA，利用Real-time PCR檢測其 miR-503及IGF-1RmRNA的表達(dá)情況。miR-503在胃癌樣本中的表達(dá)量明顯低于癌旁組織的表達(dá)量（P＜0.01）；IGF-1RmRNA的表達(dá)情況正好相反，在胃癌樣本中的表達(dá)量明顯高于癌旁組織（P＜0.01）（見圖1A、圖1B）。

2.2 平板細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測miR-503對胃癌細(xì)胞增殖的影響

用平板細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測人胃癌細(xì)胞系MGC-803和SGC-7901的增殖能力，與對照組比較，轉(zhuǎn)染了 miR-503模擬物的 MGC-803和SGC－7901細(xì)胞的克隆數(shù)目均有明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）（見圖2）。

2.3 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測miR-503對胃癌細(xì)胞侵襲能力的影響

用Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移能力，結(jié)果顯示，相較于對照組，轉(zhuǎn)染miR-503模擬物的MGC-803和SGC-7901的細(xì)胞穿透膜數(shù)目均明顯減少，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（見圖3）。

2.4 Western blot檢測miR-503對IGF-1R蛋白水平的影響

用IGF-1R一抗孵育，進(jìn)行 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測miR-503對IGF-1R是否有影響。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-503模擬物的兩種胃癌細(xì)胞MGC-803和SGC-7901中IGF-1R的蛋白水平相比于對照組，均有明顯降低（見圖4）。

圖1 miR-503和IGF-1RmRNA在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)情況

圖2 平板細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測miR-503過表達(dá)對胃癌細(xì)胞增殖的影響

圖3 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測過表達(dá)miR-503對胃癌細(xì)胞侵襲的影響

圖4 Western blot檢測過表達(dá)miR－503對IGF-1R蛋白水平的影響

2.5 RNA干擾IGF-1R基因表達(dá)對胃癌細(xì)胞生長和侵襲的影響

利用 Western blot檢測IGF-1R的表達(dá)情況，相較于干擾RNA對照組，轉(zhuǎn)染了IGF-1R干擾RNA的胃癌細(xì)胞中IGF-1R的表達(dá)明顯降低。通過平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，轉(zhuǎn)染了的IGF-1R干擾RNA的細(xì)胞克隆數(shù)目均減少，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；通過Transwell小室實(shí)驗(yàn)顯示，轉(zhuǎn)染IGF-1R干擾RNA的細(xì)胞穿透膜數(shù)目較對照組均明顯減少，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（見圖5A、圖5B和圖5C）。

3 討論

MicroRNA是Lee等［6］于1993年在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類具有調(diào)控功能的內(nèi)源性非編碼RNA，其大小約20～25個(gè)核苷酸，通過與目的mRNA序列中的部分堿基序列相互配對，從而調(diào)控部分編碼蛋白的基因表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控各種不同的生物進(jìn)程。近年來研究［1－4］表明，miRNA與包括胃癌在內(nèi)的多種癌癥的發(fā)生相關(guān)，且多種miRNA可定位于基因組上與癌癥相關(guān)的脆性位點(diǎn)，可見其在癌癥的發(fā)生過程中起著至關(guān)重要的作用。因此，miRNA越來越多地引起研究者關(guān)注，這也將使miRNA成為疾病診斷潛在的生物學(xué)標(biāo)記，還可能使這一分子成為藥物靶標(biāo)，或是模擬miRNA分子進(jìn)行新藥物研發(fā)，可能會給人類疾病的治療提供一種新的手段。

越來越多的研究表明，miRNA在腫瘤中起著原癌基因或抑癌基因的作用，與胃癌有著密切的關(guān)系。Chan等［7］通過研究發(fā)現(xiàn)，大部分胃癌患者中miR-21都在腫瘤中出現(xiàn)過度表達(dá)；Liu等［8］研究發(fā)現(xiàn)，miR-27a在胃腺癌中表現(xiàn)上調(diào)，抑制miR-27a將明顯抑制胃癌細(xì)胞的生長；Arisawa等［9］發(fā)現(xiàn)，miR-27a基因區(qū)域多態(tài)性可能是促進(jìn)胃黏膜萎縮的重要因子。

最新研究［10，11］發(fā)現(xiàn)，miR-503在肝癌、肺癌中有明顯表達(dá)差異。此外，miR-503在胃癌細(xì)胞中低表達(dá)［5］。本實(shí)驗(yàn)通過 Real-time PCR對10例胃癌組織和癌旁組織進(jìn)行檢測，證實(shí)了miR-503在胃癌組織中確實(shí)呈現(xiàn)低表達(dá)。在 MGC-803和SGC-7901的兩種人胃細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-503模擬物，平板細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過表達(dá)miR-503可以明顯抑制胃癌細(xì)胞的增殖，同時(shí)Transwell實(shí)驗(yàn)表明，過表達(dá)miR-503的胃癌細(xì)胞侵襲能力明顯減弱。兩種細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，提示miR-503可能作為一種抑癌基因，參與抑制了腫瘤的生長和侵襲。

IGF-1R是IGF信號通路的關(guān)鍵蛋白，包括三陰性乳腺癌、胃癌［12，13］在內(nèi)的多種惡性癌癥中均有高表達(dá)。大量流行病學(xué)以及臨床病理學(xué)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，由于胰島素樣生長因子1（IGF-1）的上調(diào)，IGF-1R在多種腫瘤細(xì)胞中均存在過量表達(dá)，其表達(dá)量和腫瘤發(fā)生率呈高度相關(guān)，因此，可以認(rèn)為IGF-1R是具有良好開發(fā)前景的腫瘤治療靶點(diǎn)，尋找新的IGF-1R高選擇性的抑制劑則具有重要的臨床意義和應(yīng)用前景。研究［14］表明，miR-503在神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中可以通過抑制IGF-1R的表達(dá)來發(fā)揮抑癌基因的作用。本研究通過Western blot的檢測結(jié)果顯示，過表達(dá) miR-503的胃癌細(xì)胞 MGC-803和SGC-7901的IGF-1R蛋白水平均有明顯降低；且通過siRNA敲除人胃癌細(xì)胞系 MGC-803和SGC－7901中的IGF-1R后，平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲除IGF-1R的表達(dá)后，細(xì)胞克隆形成能力和侵襲能力表現(xiàn)出相似的降低趨勢，進(jìn)一步證實(shí)了miR-503通過靶定IGF-1R基因調(diào)控胃癌細(xì)胞的生長和侵襲，發(fā)揮著抑癌基因的作用。

圖5 RNA干擾IGF-1R基因表達(dá)對胃癌細(xì)胞生長和侵襲的影響

綜上所述，在人胃癌細(xì)胞中miR-503通過靶定IGF-1R基因進(jìn)而調(diào)控胃癌細(xì)胞的生長和侵襲，發(fā)揮著抑癌基因的作用，該結(jié)果為探索治療胃癌的新分子標(biāo)記物提供了新策略。

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