耿興敏，張超儀，尹增芳

(1.南京林業(yè)大學(xué) 風(fēng)景園林系，江蘇南京 210037;2.南京林業(yè)大學(xué)森林資源與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210037)

我國野生杜鵑花資源豐富，占世界杜鵑花資源的半數(shù)以上［1］，但我國對于杜鵑花資源的應(yīng)用與研究，尤其是新品種選育方面，還相當(dāng)薄弱，僅限于張長芹［2］、劉曉青［3］等的報(bào)道.國外有關(guān)杜鵑花雜交育種的研究起步較早，雜交育種相關(guān)的研究也有大量報(bào)道，到2002年為止，登記的杜鵑花新品種已經(jīng)有28 000種［4］.杜鵑花種間雜交障礙存在著受精前與受精后障礙.杜鵑種間雜交授粉后，花粉基本在柱頭都可以萌發(fā)，但柱頭表面可能會(huì)產(chǎn)生胼胝質(zhì)阻止花粉管進(jìn)入花柱，在進(jìn)入花柱后，花粉管也可能發(fā)生頂端膨大、變形、停止生長等現(xiàn)象，或花粉管無法進(jìn)入胚珠以及花粉管在胚囊過度生長等［5－7］.花粉管的生長受阻可能發(fā)生在不同的部分，不同雜交組合中花粉管生長受阻的部位存在種間差異［6］.有報(bào)道稱蒙導(dǎo)授粉和正己烷處理可以克服杜鵑受精前障礙［8］.受精后障礙主要表現(xiàn)為胚珠停止發(fā)育，種子不萌發(fā)或萌發(fā)率很低以及后代出現(xiàn)白化苗等現(xiàn)象［9－11］.胚拯救是克服受精后障礙的有效技術(shù)手段，在杜鵑育種中也有報(bào)道［12］.在常綠杜鵑與黃花落葉杜鵑雜交過程中，常出現(xiàn)白化苗現(xiàn)象，Ureshino等［13－14］利用三重雜交、回交和倍性雜交等有效克服了受精后障礙并獲得綠色幼苗.

近年來，各地紛紛展開了野生杜鵑的引種馴化工作，但由于野生杜鵑大多分布在高山地區(qū)，生長發(fā)育要求冷涼的環(huán)境條件，對高溫的忍耐力不強(qiáng)，杜鵑屬植物，尤其是常綠品種的引種栽培至今沒有成功［15－16］.高溫脅迫嚴(yán)重影響了杜鵑花在我國城市中的推廣應(yīng)用.

因此該研究以培育耐熱性強(qiáng)、生態(tài)適宜范圍廣的杜鵑新品種為目的，以南京地區(qū)栽培的耐熱性較好的映山紅(Rhododendron simsii)和錦繡杜鵑(Rhododendron pulchrum)為母本，自交的同時(shí)，與高海拔地區(qū)引種的杜鵑屬其他各種進(jìn)行雜交.利用熒光顯微鏡觀察這些雜交組合授粉后花粉管的生長狀況，分析其遠(yuǎn)緣雜交親和性的同時(shí)，進(jìn)一步明確杜鵑雜交存在的種間雜交受精前、后障礙，為我國野生杜鵑的雜交育種提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

以南京地區(qū)栽培的映山紅(R.simsii)、錦繡杜鵑(R.pulchrum)為母本，自交的同時(shí)，以表1所列野生杜鵑種為父本(花粉來自中科院昆明植物園)，配置雜交組合.

表1 各杜鵑野生種的學(xué)名、分類及編號(hào)Tab.1 Latin name and classification of wild Rhododendron and their abbreviations

1.2 試驗(yàn)方法

2011年4月中旬開花前3 d對母本進(jìn)行去雄套袋，待柱頭分泌大量黏液時(shí)選擇于當(dāng)天上午9:00—12:00進(jìn)行常規(guī)人工授粉，各組合至少重復(fù)15朵花.授粉24、48、72 h后采集花柱及子房，每個(gè)雜交組合取5朵花.參照Ureshino等［5］的方法，將柱頭等用FAA液固定24 h后，置于70%的酒精內(nèi)，于4℃條件下保存，用于解離、染色和觀察.用3 mol·L－1的NaOH溶液45℃水浴解離3 h，解離前后都要用蒸餾水沖洗，然后用0.1%的苯胺藍(lán)(0.1 mol·L－1K3PO4·7H2O緩沖液)染色3 h，壓片后使用Leica DM500B熒光顯微鏡觀察、拍照.統(tǒng)計(jì)花粉管生長數(shù)量及其異?；ǚ酃艿谋嚷?

2 結(jié)果與分析

2.1 不同雜交組合花粉管異常生長狀況分析

雜交授粉后花粉管生長狀況如圖1所示.圖1中:(1)映山紅×白花杜鵑，花粉管在柱頭萌發(fā)，并向下開始生長(箭頭所示);(2)映山紅×白花杜鵑，花粉管在柱頭上部生長，部分花粉管出現(xiàn)膨大、扭曲生長(箭頭所示);(3)映山紅×白花杜鵑，花粉管在柱頭下部生長，胼胝質(zhì)規(guī)則分布(箭頭所示);(4)映山紅×白花杜鵑，雜交授粉3 d后花粉管進(jìn)入胚囊;(5)錦繡杜鵑×薄皮杜鵑，授粉5 d后，大多花粉管在柱頭纏繞(箭頭所示)，沒有進(jìn)入花柱道，花粉管有胼胝質(zhì)不規(guī)則沉積(箭頭所示);(6)映山紅×薄皮杜鵑，花粉管粗細(xì)不均(箭頭所示);(7)錦繡杜鵑×滇南杜鵑，花粉管在柱頭表面打結(jié)(箭頭所示);(8)映山紅×滇南杜鵑，花粉管在花柱內(nèi)螺旋、打結(jié)(箭頭所示);(9)映山紅×露珠杜鵑，花粉管破裂(箭頭所示);(10)錦繡杜鵑×薄皮杜鵑，花粉管螺旋生長、粗細(xì)不均(箭頭所示);(11)錦繡杜鵑×紅露珠杜鵑，先端沉積胼胝質(zhì)塞(箭頭所示);(12)錦繡杜鵑×睫毛杜鵑，花粉管卷曲、雜亂生長(箭頭所示);(13)錦繡杜鵑×露珠杜鵑，花粉管尖端膨大成氣球狀(箭頭所示);(14)映山紅×滇南杜鵑，雜交后子房未見膨大，但雜交24 h后花粉管就進(jìn)入胚囊(箭頭所示);(15)映山紅×美容杜鵑，花粉管在子房內(nèi)螺旋生長(箭頭所示);(16)映山紅×映山紅(昆明)，花粉管正常生長.

總之，該試驗(yàn)所配置的雜交組合中，所有花粉在授粉1 d后都能在柱頭萌發(fā)，雜交親和的花粉在花柱上部花粉管也部分出現(xiàn)異常，但大多數(shù)花粉仍能繼續(xù)生長進(jìn)入胚囊(圖1(1)～1(4)).雜交親和性較差的組合，如圖1(5)所示，錦繡杜鵑×薄皮杜鵑在授粉5 d后大多數(shù)花粉還在柱頭盤旋，沒有進(jìn)入花柱.所有雜交組合花粉管生長狀況的觀察結(jié)果表明，花粉管異常現(xiàn)象主要表現(xiàn)為花粉管粗細(xì)不均、螺旋、破損、尖端膨大、雜亂生長、胼胝質(zhì)沉積等異常情況(圖1(6)，圖1(9)～1(15))，少數(shù)組合出現(xiàn)花粉管打結(jié)現(xiàn)象(圖1(7)和1(8))，如映山紅×大字杜鵑、映山紅×薄皮杜鵑、錦繡杜鵑×美容杜鵑、錦繡杜鵑×薄皮杜鵑等.還有一些雜交組合，如錦繡杜鵑×薄皮杜鵑、映山紅×薄皮杜鵑出現(xiàn)較多的異常類型.

圖1 雜交授粉后花粉管生長狀況分析Fig.1 Pollen tube growth after pollination

2.2 不同雜交組合花粉管生長狀況

2.2.1 映山紅雜交組合

如圖2所示，以映山紅作為母本時(shí)，所有雜交組合的花粉在授粉24后，映山紅自交、映山紅×映山紅(昆明)、映山紅×薄皮杜鵑以及映山紅×滇南杜鵑組合的花粉管已穿過花柱進(jìn)入子房.其他雜交組合，其父本花粉也都能夠在柱頭表面萌發(fā)，但進(jìn)入花柱通道內(nèi)的花粉管數(shù)量及異?；ǚ酃艿谋嚷?，因雜交組合不同而有所不同.進(jìn)入花柱的花粉管數(shù)量大于50根的父本花粉，包括睫毛杜鵑、白花杜鵑、紅花露珠杜鵑以及映山紅自交花粉，但紅花露珠杜鵑以及映山紅自交花粉有70%以上出現(xiàn)花粉管異常現(xiàn)象.大白杜鵑、美容杜鵑、馬纓杜鵑及大字杜鵑萌發(fā)花粉中，進(jìn)入花柱的花粉管數(shù)量較少，不到20根，但異?；ǚ酃鼙壤灿兴档?另外，映山紅×露珠杜鵑的雜交花粉，進(jìn)入花柱的花粉管數(shù)量較少，但異?；ǚ酃艿谋壤芨?

圖2 授粉后花粉管在映山紅柱頭中生長狀況及異?；ǚ酃鼙壤鼺ig.2 Pollen tube growth on stigmas and into the style of R.simsii after pollination and frequency of abnormal pollen tubes

授粉72 h后，大部分雜交組合進(jìn)入花柱中的花粉管數(shù)量均多于授粉后24 h，但映山紅×馬纓杜鵑組合進(jìn)入花柱的花粉管數(shù)量未見增加，仍少于20.并且隨著進(jìn)入花柱花粉管數(shù)量的增加，部分雜交組合，如映山紅×睫毛杜鵑和映山紅×大白杜鵑異?；ǚ酃艿谋壤苍谠黾?除了映山紅×露珠杜鵑、映山紅×大字杜鵑、映山紅×馬纓杜鵑、映山紅×白花杜鵑以及映山紅×窄葉杜鵑以外，大部分雜交組合在授粉72 h后，花粉管都伸入了子房.

授粉120 h后，各組合花粉管進(jìn)入花柱的數(shù)量也有所增加(＞20根)，且各進(jìn)入花柱的花粉管均能到達(dá)花柱底部.但個(gè)別組合，如映山紅×薄皮杜鵑、映山紅×滇南杜鵑異?；ǚ酃艿谋壤龈撸饕憩F(xiàn)為較嚴(yán)重的胼胝質(zhì)沉積、花粉管破裂等現(xiàn)象.其他組合也存在花粉管異常現(xiàn)象，但比例較低，如映山紅×睫毛杜鵑、映山紅×露珠杜鵑、映山紅×大字杜鵑、映山紅×馬纓杜鵑、映山紅×美容杜鵑.

2.2.2 錦繡杜鵑雜交組合

授粉后花粉管在錦繡杜鵑柱頭中生長狀況及異常花粉管比例如圖3所示.

圖3 授粉后花粉管在錦繡杜鵑柱頭中生長狀況及異?；ǚ酃鼙壤鼺ig.3 Pollen tube growth on stigmas and into the style of R.pulchrum after pollination and frequency of abnormal pollen tubes

由圖3可知，以錦繡杜鵑作為母本時(shí)，不同種類父本各花粉雖然亦能在柱頭表面萌發(fā)，但花粉粒附著數(shù)量、萌發(fā)數(shù)量與花粉管長度等卻存在顯著差異.授粉24 h后，大部分組合花粉在柱頭的附著量都較多，但白花杜鵑、窄葉杜鵑和滇南杜鵑花粉在母本柱頭的附著量較少，并且除錦繡杜鵑×滇南杜鵑以外各組合花粉管均能通過柱頭進(jìn)入花柱.有部分組合萌發(fā)的花粉管數(shù)量在50根以上，如錦繡杜鵑×映山紅、錦繡杜鵑×大字杜鵑與錦繡杜鵑×睫毛杜鵑，但花粉管異常的比率高達(dá)31% ～100%.與映山紅為母本的雜交組合相比，大部分組合花粉管數(shù)量都比較少，并且可以發(fā)現(xiàn)，除了錦繡杜鵑×薄皮杜鵑、錦繡杜鵑×美容杜鵑、錦繡杜鵑×馬銀花與錦繡杜鵑×白花杜鵑以外，較多花粉管存在胼胝質(zhì)過量沉積或者粗細(xì)不一現(xiàn)象.同時(shí)，僅部分組合的花粉管能夠在24 h內(nèi)達(dá)到花柱底部，如錦繡杜鵑×映山紅、錦繡杜鵑×大白杜鵑與錦繡杜鵑×白花杜鵑.

與授粉第24 h相比，授粉72 h后，大部分雜交組合中進(jìn)入花柱的花粉管數(shù)量都有所增加，但是穿過花柱進(jìn)入子房的雜交組合數(shù)量并未增多，僅部分組合的花粉管繼續(xù)向下生長，如錦繡杜鵑×紅花露珠杜鵑、錦繡杜鵑×大字杜鵑、錦繡杜鵑×馬纓杜鵑、錦繡杜鵑×窄葉杜鵑、錦繡杜鵑×馬銀花、錦繡杜鵑×滇南杜鵑，其中錦繡杜鵑×紅花露珠杜鵑、錦繡杜鵑×大字杜鵑、錦繡杜鵑×馬銀花與錦繡杜鵑×滇南杜鵑等組合的花粉管的70%都存在異常現(xiàn)象.

授粉后120 h后，包括自交在內(nèi)的14個(gè)雜交組合當(dāng)中，有8個(gè)雜交組合的花粉管進(jìn)入花柱底部，其中錦繡杜鵑自交、錦繡杜鵑×映山紅(昆明)、錦繡杜鵑×白花杜鵑有較多花粉管到達(dá)花柱底部(＞50根)，異?；ǚ酃軘?shù)量較少(＜30%)，其他5個(gè)組合進(jìn)入花柱底部的花粉管數(shù)量較少，并且錦繡杜鵑×紅花露珠杜鵑、錦繡杜鵑×馬纓杜鵑及錦繡杜鵑×美容杜鵑3個(gè)組合的異?；ǚ酃鼙壤^高.

3 討論

親和性授粉在花柱道和胎盤凹槽生長期間，花粉管是直的、末端半透明(稱為帽區(qū))，在帽區(qū)后邊相隔一定距離有規(guī)則的胼胝質(zhì)沉積［6］.映山紅、錦繡杜鵑自交、雜交后，花粉管的生長出現(xiàn)扭曲、螺旋、膨大、斷裂和胼胝質(zhì)過量沉積等異常情況.Williams等［6］在杜鵑遠(yuǎn)緣雜交時(shí)還發(fā)現(xiàn)受精后花粉管末端漸縮、有尖刺等其他花粉管生長異?，F(xiàn)象.花粉管異常情況出現(xiàn)的類型與雜交親和性無直接聯(lián)系，即使自交的組合也發(fā)現(xiàn)花粉管螺旋、破損、胼胝質(zhì)過量沉積等異常的情形，部分組合如:錦繡杜鵑×薄皮杜鵑雜交組合，除以上異常狀況外，還發(fā)現(xiàn)花粉管打結(jié)、雜亂生長、先端膨大等異常，在所有異常情況中較多組合出現(xiàn)花粉管胼胝質(zhì)過量沉積、螺旋，而花粉管打結(jié)現(xiàn)象較少.

根據(jù)Williams等［6］在杜鵑花科遠(yuǎn)緣雜交研究中的發(fā)現(xiàn)，花粉管的生長受阻可能發(fā)生在7個(gè)不同的部分:①花粉在柱頭表面無法萌發(fā);②花粉粒萌發(fā)，產(chǎn)生花粉管，但花粉管在柱頭表面發(fā)生異常;③花粉管進(jìn)入花柱道，但在花柱道內(nèi)出現(xiàn)異常;④花粉管無法進(jìn)入子房;⑤花粉管進(jìn)入子房，但不能進(jìn)入珠孔;⑥花粉管進(jìn)入珠孔，但無法進(jìn)入胚囊;⑦花粉管無法在胚囊內(nèi)釋放精子.不同雜交組合中花粉管生長受阻的部位存在種間差異.

該研究以映山紅作為母本雜交，各父本花粉都能夠在映山紅柱頭上附著并萌發(fā)，并且各父本花粉管基本上都能到達(dá)花柱下部，雖然不同雜交組合花粉管的生長速度、到達(dá)花柱基部的比率及異常花粉管的比率等存在顯著差異(圖2).個(gè)別組合，如映山紅×馬纓花、映山紅×滇南杜鵑雜交2個(gè)月后子房未見膨大［17］，但在研究中也觀察到有花粉管進(jìn)入胚珠(圖1(14)).解瑋佳等［18］在高山杜鵑與大喇叭杜鵑(R.excellens)雜交時(shí)也有類似發(fā)現(xiàn)，即有花粉管進(jìn)入胚囊，但未見子房膨大.花粉管進(jìn)入胚囊，并不一定能夠完成受精作用，可能會(huì)出現(xiàn)胚囊不親和現(xiàn)象，即花粉管進(jìn)入胚囊并釋放出精子，但精子卻不能有效地與雌配子結(jié)合實(shí)現(xiàn)雙受精，這在玉米等作物的遠(yuǎn)緣雜交中也有報(bào)道［19］.在杜鵑雜交研究中發(fā)現(xiàn)，花粉管進(jìn)入胚囊后，會(huì)因出現(xiàn)過度生長等情況，而無法完成受精［7］.該研究還發(fā)現(xiàn)部分雜交組合在萌發(fā)初期，或花柱中、上部出現(xiàn)異?；ǚ酃埽谙虏炕謴?fù)正常，進(jìn)入胚囊.Williams等［6］發(fā)現(xiàn)異常的花粉管也能伸入胚囊，但是否能順利完成受精，還需要進(jìn)行進(jìn)一步胚胎發(fā)育學(xué)研究.

錦繡杜鵑作為母本雜交時(shí)，僅種內(nèi)及映山紅組內(nèi)雜交72 h后，有花粉管進(jìn)入花柱下部(圖3)，這幾個(gè)雜交組合也獲得了種子［17］.杜鵑亞屬、馬銀花亞屬以及同一亞屬不同組的大字杜鵑花粉管沒能到達(dá)花柱基部，在花柱通道內(nèi)花粉管的生長受阻，或因其生長速度過慢，在授粉72 h后花粉管仍未能達(dá)到花柱底部;并且這些雜交組合中異常花粉管的比率也較高(圖3).這些雜交組合在雜交后均未獲得雜交種子，雖然部分雜交組合，如錦繡杜鵑×大字杜鵑、錦繡杜鵑×睫毛杜鵑等，雜交2個(gè)月后有子房膨大現(xiàn)象，但并未正常發(fā)育，形成種子［17］，這表明這些雜交組合同時(shí)存在受精后障礙.

整體來看，雜交親和性較好的組合，花粉管生長速度較快，到達(dá)花柱底部的花粉管比率較高，如映山紅自交及種內(nèi)雜交.Williams和Rouse［20］的研究表明，花粉管生長速度及進(jìn)入子房的時(shí)間與雌蕊花柱長度有關(guān)，父本/母本的柱頭長度比(SLR)顯著影響種間雜交成功率，比值越接近1，雜交成功率越高.映山紅做母本時(shí)，花粉管到達(dá)花柱底部的雜交組合多于錦繡杜鵑母本，異常花粉管比率低(＜30%)，這表明作為母本，映山紅種間雜交親和性要優(yōu)于錦繡杜鵑.這一結(jié)果也表明母本的不同可能導(dǎo)致花粉管生長狀況不同;同種母本因父本的不同也可能對花粉管的生長情況有不同影響，Ureshino等［5］的研究中也有類似報(bào)道.

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