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(1.晨光生物科技集團股份有限公司,邯鄲 057250；2.河北省天然色素工程技術研究中心,邯鄲 057250)

凝膠滲透色譜-高效液相色譜熒光法測定脂溶性天然色素中特丁基對苯二酚

孫建玲1,2,楊清山1,2,張玉芬1,高偉1,2，*

(1.晨光生物科技集團股份有限公司,邯鄲 057250；2.河北省天然色素工程技術研究中心,邯鄲 057250)

建立了脂溶性天然色素中特丁基對苯二酚(TBHQ)的檢測方法。樣品經凝膠滲透色譜(GPC)技術去除色素和脂類,高效液相色譜熒光法進行定性、定量分析。加標水平為0.5～1.5mg/kg時,TBHQ的回收率為85.50%～103.33%,相對標準偏差為1.06%～7.04%。方法檢出限0.1mg/kg。本方法具有凈化效果好,準確靈敏,回收率高等優(yōu)點,適用于脂溶性天然色素中特丁基對苯二酚的檢測。

凝膠滲透色譜,高效液相色譜熒光法,特丁基對苯二酚,脂溶性天然色素

特丁基對苯二酚(TBHQ)作為一種有效的抗氧化劑,常被添加到油脂和富脂食品中[1-3],但是大量食用TBHQ會有致畸、致癌的風險,所以TBHQ的使用量受到嚴格限制和嚴格監(jiān)控。目前,TBHQ檢測主要針對食用油、工業(yè)用油、富脂食品和食品包裝材料等,尚未發(fā)現對脂溶性天然色素如辣椒紅和葉黃素等中TBHQ含量檢測方法的報道。因此開發(fā)脂溶性天然色素中TBHQ的檢測方法是十分必要的。國內外TBHQ的檢測手段主要有氣相色譜法[4-5]、高效液相色譜法[6-7]和質譜法[8-9],其中氣相色譜法靈敏度較低,易受雜峰干擾；質譜法特異性強,但成本高使之不能廣泛應用。高效液相色譜熒光法具有特異性強、靈敏度高和成本低的優(yōu)點,適用于TBHQ的檢測分析。在前處理方面,目前采用的是傳統柱層析法和有機試劑反復提取法,操作繁瑣,實驗周期長。本實驗采用的凝膠滲透色譜(GPC)以多孔凝膠為固定相,利用分離物分子量大小不同而達到分離目的,具有操作簡單、快捷等優(yōu)點,對于富含脂肪、色素和蛋白質等樣品的凈化具有明顯優(yōu)勢[10-11]。

本實驗采用GPC進行樣品前處理,高效液相色譜-熒光法測定脂溶性天然色素中TBHQ的含量,極大提高了檢測靈敏度,具有良好的適用性,為脂溶性天然色素中TBHQ含量的測定提供了一種可靠的分析手段。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

環(huán)己烷(分析純,重蒸)；乙酸乙酯(分析純,重蒸)；甲醇(色譜純)；乙酸(色譜純)；TBHQ(分析純,99%,CAS.No:1948-33-0)。

高效液相色譜系統Agilent 1260型,配有熒光檢測器 安捷倫科技有限公司；凝膠滲透色譜儀J2 Preplinc 普利泰科儀器)；旋轉蒸發(fā)器R201BL 上海申生科技有限公司；萬分之一天平AUY220 島津；超聲波清洗機TH600 濟寧天華超聲電子儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1標準溶液的配制 準確稱取100mg TBHQ標準品,以色譜甲醇溶解并定容至100mL,配制成濃度為1000μg/mL標準儲備液,置4℃冰箱中保存,有效期為7天。精密稱取標準儲備液適量,用色譜甲醇稀釋至所需濃度,濃度分別為0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0μg/mL,現用現配。

1.2.2 樣品制備

1.2.2.1 辣椒紅 稱取混合均勻的辣椒紅1.0000g,用重蒸后的GPC流動相(1∶1,V/V)定容至10mL,振蕩或超聲溶解后過0.45μm濾膜至GPC進樣管中,待GPC凈化。

1.2.2.2葉黃素油 稱取葉黃素油1.0000g,后按1.2.2.1進行。

1.2.2.3 GPC凈化 用乙酸乙酯-環(huán)己烷(1∶1,V/V)作為GPC流動相,流速為4.7mL/min,檢測紫外吸收波長為254nm,流動相收集時間25-35min。將收集的濾液旋蒸近干,用1.0 mL色譜甲醇溶解,后過濾膜進行液相檢測。

1.2.3 標準曲線的繪制 將標準系列濃度為0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0μg/mLTBHQ標準溶液進行HPLC檢測,記錄色譜圖；以TBHQ溶液濃度(μg/mL)為橫坐標X,HPLC測定的TBHQ的響應面積為縱坐標Y,所得回歸方程,即為標準曲線。

1.2.4 精密度考察 取同批次加標水平為1.0mg/kg辣椒紅和葉黃素油樣品,經GPC前處理后連續(xù)5次測定進行精密度實驗。根據樣品結果計算本方法的精密度。

1.2.5 重現性考察 取同批次加標水平為0.5mg/kg辣椒紅和葉黃素油樣品各5份,凈化處理后作重復性實驗,評價結果的重現性。

1.2.6 回收率考察 取辣椒紅和葉黃素油樣品,分別加入TBHQ標準品至0.5、1.0和1.5mg/kg三個水平。每濃度平行三樣本,按1.2.2操作后完成樣品制備。在確定的色譜條件下進行HPLC測定,計算日內回收率。連續(xù)考察3d,計算日間回收率。

1.2.7 穩(wěn)定性考察 對加標水平為1.0mg/kg的辣椒紅、葉黃素油樣品連續(xù)5天進行TBHQ含量測定,作TBHQ在樣品中的穩(wěn)定性考察。

1.2.8 色譜條件 Diamonsil C18色譜柱(250mm×4.6mm,3.5μm)；流動相A為1.0%乙酸水溶液,流動相B為乙腈,VA∶VB=60%∶40%等度洗脫；流速1.0mL/min；柱溫40℃；進樣量20μL；最大激發(fā)波長λex為293nm,最大發(fā)射波長λem為332nm。

1.2.9. 分析樣品 在相同液相色譜條件下,對系列標準溶液和樣品溶液進行測定,以保留時間定性,以樣品響應峰面積和標準峰面積比較定量。

2 結果與分析

2.1凈化方式

GPC能有效去除樣品中油脂和色素等大分子的干擾,可用于脂質和色素含量較高的基質的凈化。本研究采用GPC凈化脂溶性色素樣品。辣椒紅、TBHQ標準溶液和加入TBHQ標準品后的辣椒紅的紫外色譜圖見圖1。結果表明,脂類和大多數色素在前25min內流出GPC柱(圖1A),TBHQ在25～35min流出(圖1B)。絕大多數辣椒紅可與TBHQ有效分離,收集25-35min內樣品可獲得凈化后的目標物(圖1C)。

圖1 辣椒紅和TBHQ GPC圖Fig.1 Gel permeation chromatography of paprika red and TBHQ(20μg/mL)注:A:辣椒紅GPC圖；B:TBHQ(20μg/mL)GPC圖； C:加標后辣椒紅GPC圖。

2.2流動相的選擇

對于TBHQ的測定,一般采用乙腈、甲醇和水作為流動相在反相C18色譜柱上進行色譜分離。本實驗分別以乙腈、甲醇和乙腈-甲醇(1∶1,V/V)為流動相進行樣品測定發(fā)現,乙腈為流動相可使相應信號最強。水相中加入乙酸可優(yōu)化峰形[12-13],防止峰拖尾現象。當乙酸濃度低于0.5%時,有色譜峰拖尾現象；乙酸濃度大于5%時,儀器損害較大。實驗表明,采用1%乙酸可獲得理想的峰形。等度流動相1%乙酸水-乙腈溶液即可有效分離雜質與TBHQ峰,適用于TBHQ的檢測。

表1 檢測精密度結果Table 1 Precision of method

表2 重現性實驗結果Table 2 Reproducibility of method

表3 樣品回收率結果Table 3 Recoveries in paprika red and lutein

2.3穩(wěn)定性考察

在實驗進行中我們發(fā)現,隨著測定天數的增加,相同濃度的TBHQ標準溶液的響應峰面積有下降趨勢。這意味著TBHQ隨時間延長會不斷消耗。將TBHQ標準儲備液與空白辣椒紅和葉黃素油混合均勻,連續(xù)5d進行TBHQ含量測定發(fā)現,葉黃素油中的TBHQ含量存在明顯降低現象。在辣椒紅中,TBHQ的消耗并不明顯,這與樣品本身的性質相關。葉黃素油中葉黃素晶體成分本身是一種抗氧化劑,較辣椒紅更易被氧化,因此TBHQ在葉黃素油中的抗氧化保護作用更明顯,損耗較快。為保證檢測準確性,提取TBHQ后檢測應及時進行,并出具穩(wěn)定性檢測數據。

2.4方法學考察

2.4.1 線性關系和檢出限 采用1.2.3節(jié)的條件進行HPLC分析。在0.05～10.0μg/mL范圍內線性方程為Y=61.655X-2.6936,相關系數R2=0.9999。根據3倍信噪比得出方法檢出限為0.1mg/kg。相比高效液相色譜紫外檢測法檢出限0.5～5.0mg/kg[3,14],氣相色譜法檢出限5.0mg/kg[7],本方法檢測TBHQ的靈敏度很高。

2.4.2 精密度實驗 加標水平為1.0mg/kg的空白辣椒紅和葉黃素油樣品中TBHQ精密度測定結果見表1。精密度實驗中辣椒紅的相對標準偏差為1.37%,葉黃素油的相對標準偏差為1.22%。本方法測定TBHQ具有良好的檢測精密度。

2.4.3 重現性實驗 加標水平為0.5mg/kg辣椒紅和葉黃素油樣品中TBHQ含量重現性測定結果見表2。重現性實驗中辣椒紅的相對標準偏差為5.06%,葉黃素油的相對標準偏差為4.53%。因此,本方法檢測TBHQ具有較好的重復性。

2.4.4 回收率實驗 在選定的色譜條件下,對未檢出TBHQ的辣椒紅和葉黃素油分別添加TBHQ標準溶液至0.5、1.0和1.5mg/kg三個水平。按所確定的提取、凈化以及檢測條件進行加標回收率實驗?；厥章式Y果見表3。

由表3可知,辣椒紅中TBHQ的平均回收率在85.50%～97.94%,日內相對標準偏差為2.09%～5.22%,日間相對標準偏差在1.17%～7.04%。葉黃素油中TBHQ的平均回收率在92.37%～103.33%,日內相對標準偏差為1.65%～5.37%,日間相對標準偏差在1.06%～5.75%。本方法良好的回收率和準確性。

2.4.5 穩(wěn)定性實驗 對辣椒紅、葉黃素油樣品中TBHQ含量穩(wěn)定性考察結果見表4。TBHQ在葉黃素油中有明顯損耗,而在辣椒紅樣品中的消耗并不明顯。因此測定TBHQ時,為保證檢測準確性,應提供穩(wěn)定性檢測數據。

2.4.6 樣品檢測 利用本方法分別對3組不同批次的辣椒紅和葉黃素油進行分析。檢測結果表明兩種樣品共6批次在9.354min均未出現目標峰(圖2B),因此確定產品辣椒紅和葉黃素油中TBHQ含量低于檢出限。對辣椒紅色素和葉黃素油樣品進行加標,在9.354min有明確TBHQ峰出現(圖2C),TBHQ目標峰與辣椒紅中的雜質峰或特征峰得到很好地分離,可完成TBHQ的準確測定,見圖2。

表4 穩(wěn)定性實驗結果Table 4 Stability of TBHQ in paprika red and lutein

圖2 TBHQ色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of TBHQ注:A:TBHQ標準品的色譜圖(含量10μg/mL,保留時間為 9.354min)；B:辣椒紅中TBHQ測定譜圖； C:加標后辣椒紅中TBHQ測定譜圖。

3 結論

本研究結果表明,利用凝膠滲透色譜凈化系統對脂溶性天然色素進行樣品前處理,在保證較高回收率和精密度的前提下可用于測定脂溶性天然色素中TBHQ的含量。確定了色譜條件:色譜柱為Diamonsil C18柱(250mm×4.6mm,3.5μm)；流動相A為1.0%乙酸水溶液,流動相B為乙腈,以A∶B為60∶40比例等度洗脫；流速1.0mL/min；柱溫40℃；進樣量20μL；最大激發(fā)波長為293nm,最大發(fā)射波長為332nm。結果顯示TBHQ的線性范圍為0.05～10.0μg/mL(R2=0.9999)精密度小于5%,重復性和回收率較好。方法具有靈敏度高,操作簡便等優(yōu)點,為脂溶性天然色素中TBHQ含量的測定提供了可靠的分析手段。

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Determination of tert-butylhydroquinone in fat-soluble pigments by gel permeation chromatography and high performance liquid chromatography with fluorometric detector

SunJianling1,2,YangQingshan1,2,ZhangYufen1,GAOWei1,2，*

(1.Chenguang Biotech Group Co.,Ltd.,Handan 057250，China;2.Hebei Engineering Technology Research Center of Natural Pigments,Handan 057250,China)

A novel method was developed for the determination of tert-butylhydroquinone(TBHQ)in fat-soluble pigments using gel permeation chromatography(GPC)and high performance liquid chromatography with fluorometric detector. The average recoveries of TBHQ were 85.50%～103.33%,spiked at the level of 0.5～1.5mg/kg. The relative standard deviations were in the range of 1.06%～7.04%,and the procedure allows the detection of 0.1mg/kg. The method was rapid,precise and high efficient. It can be extended to the analysis for TBHQ in fat-soluble pigments.

gel permeation chromatography;high performance liquid chromatography with fluorometric detector;tert-butylhydroquinone;fat-soluble pigments

2013-12-27 *通訊聯系人

李艷(1982-)，女，博士研究生，助理研究員，研究方向: 生物活性物質功效及應用。

廣東省科技計劃項目(2011B010500006);廣東省高等職業(yè)院校珠江學者崗位計劃資助項目(2011)。

TS207.3

A

1002-0306(2014)17-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2014.17.001