楊宏

(河北省唐山工人醫(yī)院 放化療科,河北 唐山 063000)

應(yīng)用直腸癌QPCR數(shù)據(jù)篩選差異表達(dá)基因并探索其與臨床參數(shù)間的相關(guān)性

楊宏

(河北省唐山工人醫(yī)院 放化療科,河北 唐山 063000)

目的 研究在直腸癌組織與正常直腸組織中的微小RNA（miRNA)表達(dá)差異，并分析其與臨床指標(biāo)的關(guān)系，探討血清微小RNA在直腸癌中診斷和預(yù)后的應(yīng)用價(jià)值。方法 選取12例直腸癌患者，手術(shù)后取癌組織標(biāo)本，QPCR檢測(cè)miRNA在直腸癌組織與癌旁組織中的表達(dá)，篩選具有差異表達(dá)的miRNA。通過聚類分析，并篩選出P＜0.001的miRNA，分析基因間的聚集性；并進(jìn)一步探討直腸癌患者臨床病理參數(shù)、不同臨床分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與篩選的miRNA之間的相關(guān)性。結(jié)果 在變化倍數(shù)＞1.6，P＜0.01的條件下初步篩選得到26個(gè)結(jié)腸癌患者具有差異表達(dá)miRNA，聚類分析P＜0.001下，篩選出3大類具有相似性的基因和3組具有相似性的個(gè)體。miRNA100、miRNA125a-5p、miRNA125b、miRNA145、miRNA145*和癌細(xì)胞淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)系。miRNA9在腫瘤樣本中高表達(dá)，在對(duì)應(yīng)患者中隨著vilin基因增高表達(dá)下調(diào)，表明其作為疾病相關(guān)的癌基因和疾病的發(fā)生機(jī)制有關(guān)。CK20指標(biāo)和miRNA4770、miRNA4700-5p呈高度負(fù)相關(guān)（P＜0.05)。 結(jié)論 miRNA1，miRNA145，miRNA4799-5p，miRNA-4790-5p等 miRNAs可作為診斷的分子靶標(biāo)指導(dǎo)結(jié)腸癌的診斷。microRN100，miRNA145等miRNAs可能成為一種非侵入性的分子靶標(biāo)顯示是否為結(jié)腸癌。

直腸癌；QPCR；miRNA；相關(guān)性

miRNA即微小RNA也稱microRNA,是長度約19～25個(gè)核苷酸的高度保守的小片段非編碼RNA,能夠與靶mRNA的3'非轉(zhuǎn)錄區(qū)堿基不完全或完全配對(duì),并在轉(zhuǎn)錄后水平通過降解靶mRNA或抑制翻譯過程而發(fā)揮負(fù)調(diào)控基因表達(dá)的過程,與細(xì)胞的分化、增殖、凋亡密切相關(guān)［1-2］。直腸癌是我國危害極大的惡性腫瘤之一,發(fā)病率高且呈現(xiàn)出居高不下的趨勢(shì)。有研究表明,microRNA對(duì)直腸癌疾病的發(fā)生起著重要的影響［3-4］。而調(diào)查結(jié)果顯示,社區(qū)居民的結(jié)直腸癌知識(shí)水平偏低,當(dāng)被告知有危險(xiǎn)時(shí)的結(jié)直腸癌篩查意愿及參與自費(fèi)結(jié)直腸癌篩查的意愿與其知識(shí)水平呈正相關(guān)［5］。本研究分析在正常與直腸癌組織中的具有表達(dá)差異不同miRNA,分析篩選出 miRNA與直腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系,以期為腸癌腫瘤診斷和預(yù)后評(píng)價(jià)標(biāo)志物提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料 芯片在廣州復(fù)能基因有限公司檢測(cè),檢測(cè)試劑盒購自廣州復(fù)能基因有限公司。

1.2 方法 芯片檢測(cè) 本研究收集來源于2012年9月～013年9月廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院胃腸外科直腸癌切除手術(shù)患者20例。取未發(fā)生轉(zhuǎn)移的原位直腸癌組織和癌旁組織作為標(biāo)本。患者術(shù)前均未接受化療放療及其他針對(duì)腫瘤的特殊治療,術(shù)后病理診斷證實(shí)為直腸癌,術(shù)中切除原發(fā)灶后即刻取癌組織。取材部位邊緣相距至少2 cm。收集均征得患者本人的知情同意,其中男9例,女11例。臨床病理分期診斷分為Ⅰ～Ⅳ期。其中Ⅰ期患者1例,Ⅱ期患者11例,Ⅲ期患者7例,Ⅳ期患者2例。本研究檢測(cè)了 CEA(carcino-embryonic antigen)、CA199(Carbohydrate Atigen 19-9)、VEGF(vascular endothelial growth factor)、CK20(Cytokeratin 20)、p53(一種腫瘤抑制基因)、CDX2(caudal-relatedhomeodomain transcription 2)、vilin(檢測(cè)淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移)等指標(biāo)。

癌組織與癌旁組織RNA抽提使用Trizol常規(guī)方法,采用瓊脂糖凝膠電泳判斷RNA完整性,根據(jù)A260/A280判斷RNA純度,只有28S/18S≥2.0且A260/A280為1.9～2.1者才用于之后的實(shí)驗(yàn)。miRNA的cDNA合成采用特異性頸環(huán)引物,反轉(zhuǎn)錄相關(guān)操作按照試劑盒說明書操作。Real-time PCR嚴(yán)格按試劑盒操作說明進(jìn)行,PCR反應(yīng)條件:95℃變性10min,95℃變性15 s,60℃退火和延伸60 s,共40個(gè)循環(huán)。采用U6做參考基因,計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。 檢測(cè) 20 例患者 CEA、CA199、VEGF、CK20、p53、CDX2、vilin、淋巴結(jié)檢測(cè)是否轉(zhuǎn)移等指標(biāo)的數(shù)據(jù)。獲得數(shù)據(jù)為反應(yīng)結(jié)束后計(jì)算后的各反應(yīng)管內(nèi)的Ct值。miRNA表達(dá)水平采用相對(duì)定量方法,以fold chang=2-ΔΔCt表示每個(gè)miRNA的變化倍數(shù),再將結(jié)果轉(zhuǎn)化為對(duì)數(shù)形式,ΔCt=CtmiRNA-CtU6(以此表示相對(duì)表達(dá)量),ΔΔCt=ΔCt(腫瘤組)-ΔCt(對(duì)照組)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用dchip軟件分析不同樣本和不同miRNA之間的聚集性。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果采用SPSS 19.0軟件分析,數(shù)據(jù)以“±s”表示,在差值數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布下組間比較采用t檢驗(yàn);miRNA與臨床指標(biāo)間的相關(guān)分析采用Spearman秩相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 篩選的差異miRNA 根據(jù)12例直腸癌患者檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。在P＜0.05的條件下,共篩選出96個(gè)直腸癌特異性的血漿差異miRNA,其中29個(gè)miRNA在患者血漿中表達(dá)上調(diào),67個(gè)miRNA在患者血漿中表達(dá)下調(diào)。進(jìn)一步提高篩選條件,從96個(gè)基因中選擇26個(gè)相對(duì)定量變化大于1.6倍且P＜0.01的條件的miRNA(見表1、表2)。其中15個(gè)miRNA在患者血漿中表達(dá)上調(diào),11個(gè)miRNA在患者血漿中表達(dá)下調(diào)。配對(duì)t檢驗(yàn)結(jié)果表明,26個(gè) miRNA中,has-miRNA1,has-miRNA145,has-miRNA4799-5p,has-miRNA-4790-5p在2組間的差異較大,has-miRNA182,22*的2組倍數(shù)變化較小。說明這些miRNAs有可能成為診斷的分子靶標(biāo)。

表1 15個(gè)相對(duì)表達(dá)量上調(diào)的miRNATab.1 15 miRNAs that expression up-regulate relatively

表2 11個(gè)相對(duì)表達(dá)量下調(diào)的miRNATab.2 11 miRNAs that expression down-regulate relatively

2.2 聚類分析結(jié)果 采用dchip軟件進(jìn)行聚類分析,聚類分析的結(jié)果表明,microRNAs可以分為3大類,hsa-miR-4510和hsa-miR-143、hsa-miR-99a,hsa-miR-99b,microRNA363 分別為一大類。hsa-miR-22*等其余11個(gè)基因的病理組織和正常組織的基因相對(duì)表達(dá)量變化相似。hsa-miR-143和hsa-miR-27b表達(dá)結(jié)果最相近。其余類同,見圖1。同時(shí),12名患者中,p29,p15,p30患者的基因相對(duì)表達(dá)量總體差異最小。所有個(gè)體距離較近,說明患者基因檢測(cè)水平離散度很小。

圖1 個(gè)體結(jié)腸組織中microRNAs的聚類圖Fig.1 Cluster ofmicroRNAs in calon tissure

2.3 相關(guān)性分析 細(xì)胞角蛋白20簡稱CK20,已有研究表明CK20 mRNA的表達(dá)與淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)［13］。相關(guān)分析表明,CK20指標(biāo)和 miRNA4770、miRNA4700-5p呈高度負(fù)相關(guān)(見表3)。

表3 CK20與部分微小RNA的相關(guān)分析Tab.3 Analysis of correlation between CK20 and microRNAs

本研究發(fā)現(xiàn),所有篩選的病例樣本中所選基因均在癌組織中下調(diào),同時(shí)超過50%VEGF,100%Villin呈雙陽性,90%p53成雙陽性/陰性。相關(guān)分析表明,p53和miRNA182、miRNA125a-5p和miRNA126呈高度正相關(guān)(見表4)。

表4 p53與部分miRNA的相關(guān)分析Tab.4 Analysis of correlation between p53 and microRNAs

miRNA9在腫瘤樣本中高表達(dá),在對(duì)應(yīng)的患者中隨著vilin增高表達(dá)下調(diào),表明該基因作為疾病相關(guān)的癌基因和疾病的發(fā)生機(jī)制有關(guān)。miRNA143和kras之間存在相關(guān)關(guān)系,相關(guān)系數(shù)為-0.645 5,P值為0.031 9。

隨著CK20增高基因表達(dá)下調(diào)表明miRNA100、miRNA125a-5p、miRNA125b、miRNA145、miRNA145*和癌細(xì)胞淋巴轉(zhuǎn)移可能有關(guān)。可作為進(jìn)一步診斷是否淋巴轉(zhuǎn)移的依據(jù)。

3 討論

由于miRNA在人類與靶基因的作用方式為不完全結(jié)合,對(duì)靶基因發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用,且分子只有22 nt左右,理論上miRNA的靶基因很多,準(zhǔn)確預(yù)測(cè)特定的miRNA仍較困難.本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用芯片技術(shù)在直腸癌及正常直腸組織中篩選出表達(dá)上調(diào)或下調(diào)的miRNA,討論了成對(duì)的腫瘤和正常直腸組織的基因表達(dá)與直腸癌的臨床診斷的關(guān)系問題,這種技術(shù)通常是在臨床設(shè)置,選擇一小部分miRNA,在本研究中,通過實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)選擇了96個(gè)miRNA作檢測(cè)。

本文主要集中在比較正常組織的腫瘤,診斷潛力,通過相關(guān)miRNA的表達(dá)與腫瘤亞型或臨床參數(shù)的相關(guān)關(guān)系來衡量［6-8］。在本研究中,共分析了12個(gè)直腸癌樣品,在標(biāo)識(shí)表達(dá)的26個(gè)miRNA中,miRNA1,miRNA145,miRNA4799-5p,miRNA-4790-5p在2組間的差異較大,miRNA182,22*在2組間差異較小。說明這些miRNAs有可能成為診斷的分子靶標(biāo)。

miR-145在直腸癌中表達(dá)下調(diào),miR-143的表達(dá)也下調(diào),但這2個(gè)miRNAs的表達(dá)與其他臨床變量均不相關(guān)。而miRNAlet-7b、miRNA125b、miRNA100、miRNA125a-5p、miRNA125b、miRNA145、miRNA145*可能通過抑制抑癌癌基因(s)的淋巴轉(zhuǎn)移和其他有針對(duì)性的基因在直腸癌的進(jìn)展中發(fā)揮作用。雖然miRNA-143和miRNA-145不涉及病情發(fā)展。

進(jìn) 一 步 研 究 miRNA100、 miRNA125a-5p、 miRNA125b、miRNA145、miRNA145*和癌細(xì)胞淋巴轉(zhuǎn)移的關(guān)系有著重要意義。miRNA9在腫瘤樣本中高表達(dá),在對(duì)應(yīng)的患者中隨著vilin基因增高表達(dá)下調(diào),表明其作為疾病相關(guān)的癌基因可能和疾病的發(fā)生機(jī)制有關(guān)。CK20指標(biāo)和miRNA4770、miRNA4700-5p呈高度負(fù)相關(guān)［9-10］。

本文篩選了直腸癌患者癌組織和正常組織具有差異表達(dá)的微小RNA(miRNA),并找出了部分基因與臨床特征的相關(guān)關(guān)系,為進(jìn)一步直腸癌腫瘤診斷和選擇預(yù)后評(píng)價(jià)標(biāo)志物提供依據(jù)。但其靶基因仍需要試驗(yàn)驗(yàn)證,miRNA在直腸癌中的作用機(jī)制尚待闡明。相信隨著各方面研究的深入和技術(shù)的不斷進(jìn)步,miRNA將在直腸癌的早期有效診治方面發(fā)揮重要作用。

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(編校:吳茜)

Aapplication of colorectal cancer QPCR data for screening differentially expressed genes and exp lore its association w ith clinical parameters

YANG Hong

(Department of Radiotherapy and Chemotherapy,Tangshan Workers Hospital of Hebei Province,Tangshan 063000,China)

Objective To research the differences of tiny RNA(miRNA)expression between rectal cancer tissue and normal rectal tissue and analyze its relationship with clinical indicators.To explore tiny RNA's diagnostic and prognostic value in colorectal cancer research.Methods 12 cases of patients with colorectal cancer were taken cancer tissue samples after surgery,using QPCR to detectmiRNA in colorectal cancer tissues and adjacent cancer tissues and then screening differences in miRNA expression.Through cluster analysis,and screened P＜0.001 formiRNA,discover clusters of genes;and further analysis of clinic pathological parameters in patientswith colorectal cancer,clinical stage,lymph nodemetastasis's relationship with miRNAs'screening.Results Multiples of＞1.6,P＜0.01 under this conditions initially screened 26 miRNAs expressed differentially in patients with colon cancer,Cluster Analysis P＜0.001,three categories of genetic screening and similarities between three groups with similar individuals.miRNA100,miRNA125a-5p,miRNA125b,miRNA145,miRNA145*have cancer relationship with lymph node metastasis.miRNA9 expression in the tumor sample was high,and in the patients corresponding increase with vilin while downregulated genes,indicating that this gene as oncogene related diseases has relationship disease mechanisms.CK20 indicators were highly negative correlated with miRNA4770,miRN A4700-5p.Conclusion miRNA1,miRNA145,miRNA4799-5p,miRNA-4790-5p and other miRNAs can be used as a diagnostic molecular targets to guide the diagnosis of colon cancer.miRNA100,miRNA145 such aswhethermiRNAs could become a non-invasivemolecular targetmolecularmarkers of colon prompt.

colorectal cancer;QPCR;miRNA;association

R735

A

1005-1678（2014)06-0062-04

楊宏，女，本科，副主任護(hù)師，研究方向：直腸癌的治療，E-mail：yh900@sina.cn。