張玉山,高國(guó)生

(1.南陽(yáng)市中心醫(yī)院 感染科,河南 南陽(yáng) 473000;2.寧波市感染病醫(yī)院 肝病科,浙江 寧波 315000)

穩(wěn)轉(zhuǎn)STAT6-RNAi細(xì)胞株的構(gòu)建及功能鑒定

張玉山1,高國(guó)生2

(1.南陽(yáng)市中心醫(yī)院 感染科,河南 南陽(yáng) 473000;2.寧波市感染病醫(yī)院 肝病科,浙江 寧波 315000)

目的 探討RNAi慢病毒載體對(duì)HepG2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株增殖、遷移的影響。方法 感染實(shí)驗(yàn)分為4組:空白對(duì)照組（未經(jīng)處理的HepG2細(xì)胞)，陰性對(duì)照組（只感染 pLVTHm空病毒)，感染pLVTHm-STAT6-RNAi組，感染pLVTHm-STAT6-ORF組。運(yùn)用病毒感染HepG2細(xì)胞獲得穩(wěn)定表達(dá)STAT6-ORF和STAT6-RNAi的細(xì)胞株，利用PCR和Western blot的方法檢測(cè)穩(wěn)定細(xì)胞株中STAT6的表達(dá)豐度。CCK-8法檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的細(xì)胞活性及Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞遷移能力變化。結(jié)果 通過TET的篩選，成功獲得了STAT6-ORF以及STAT6-RNAi的HepG2穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。與對(duì)照組細(xì)胞相比，過表達(dá)STAT6-ORF轉(zhuǎn)染的細(xì)胞增殖快（F=4.279，P=0.021)，遷移率高；而STAT6-RNAi轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞增殖緩慢，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)及傳代（HepG2傳到第三代細(xì)胞絕大部分細(xì)胞已經(jīng)死亡)，細(xì)胞逐漸崩解、漂浮死亡，細(xì)胞活性顯著降低（F=290.114，P＜0.001)，遷移能力顯著下降。結(jié)論 成功構(gòu)建STAT6-RNAi和STAT6-ORF穩(wěn)定株，為后期建立動(dòng)物模型，體內(nèi)驗(yàn)證STAT6的生物學(xué)功能奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

慢病毒包裝；STAT6 RNAi干涉；感染；HepG2細(xì)胞

原發(fā)性肝癌(primary hepatic cancer,PHC)是一種原發(fā)于膽管細(xì)胞或肝細(xì)胞的癌癥,是臨床上最常見的惡性腫瘤之一,全球發(fā)病率居惡性腫瘤第五位。近年來(lái),隨著環(huán)境因素和社會(huì)因素的改變,肝癌的發(fā)病率也明顯提高,而且患者年齡呈年輕化趨勢(shì)。研究表明,腫瘤細(xì)胞及其周圍免疫細(xì)胞分泌的炎性因子可激活炎癥相關(guān)信號(hào)通路,誘導(dǎo)腫瘤免疫抑制微環(huán)境的形成,參與肝癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的過程。本研究擬通過構(gòu)建STAT6-RNAi和STAT6-ORF穩(wěn)定株,探討RNAi慢病毒載體對(duì)HepG2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株增殖、遷移的影響,為后期建立動(dòng)物模型,驗(yàn)證STAT6的生物學(xué)功能提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞株:人肝癌HepG2細(xì)胞株,由南方醫(yī)科大學(xué)基因工程研究所提供。

1.1.2 主要試劑:PrimerScriptTMRT-PCR試劑盒、DL2000標(biāo)準(zhǔn)分子量、Taq DNA聚合酶、Trizol試劑為大連TaKaRa公司產(chǎn)品;DMEM培養(yǎng)液、胰酶,為美國(guó)GIBCO公司產(chǎn)品;胎牛血清,杭州四季清公司;CCK-8試劑,廣州展辰生物公司;聚凝胺(polybrene),美國(guó)Sigma公司;二甲亞楓(DMSO),上海生工生物公司;聚偏二氟乙烯膜,美國(guó)Millipore公司;STAT6羊抗兔單克隆抗體,美國(guó)Epitomics公司;GAPDH羊抗鼠單克隆抗體,北京博奧森生物技術(shù)公司;彩虹Marker,加拿大Fermentas公司。BCA Protein Assay Reagent Kit(Pierce)。其他試劑均為超級(jí)純。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器:DYY-6c電泳儀、蛋白轉(zhuǎn)膜儀為北京六一儀器廠產(chǎn)品;流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter,BD);熒光倒置顯微鏡(Leica);Biorack 750液氮罐(Statebourne);TDL-4ZA低速離心機(jī);GZX-9146MBE電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);Multifuge 1L-R高速冷凍離心機(jī)(Thermo)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 篩選建立穩(wěn)定過表達(dá)和干擾STAT6細(xì)胞株

①感染目的細(xì)胞:感染前1天,胰酶消化HepG2細(xì)胞并計(jì)數(shù)細(xì)胞密度,按照2×105個(gè)/孔細(xì)胞密度接種至6孔板,加入DMEM完全培養(yǎng)液,置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng);培養(yǎng)24 h,融合度達(dá)到30%～50%后,在含有病毒的培養(yǎng)液中加入聚凝胺(polybrene,美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品,工作液濃度為6μg/m L),促進(jìn)病毒感染細(xì)胞;感染實(shí)驗(yàn)分為4組:空白對(duì)照組(未經(jīng)處理的HepG2細(xì)胞)、陰性對(duì)照組(只感染pLVTHm空病毒)、感染 pLVTHm-STAT6-RNAi組、感染 pLVTHm-STAT6-ORF組;吸去細(xì)胞中的培養(yǎng)液后,加入含有10倍稀釋病毒量的完全培養(yǎng)液1mL/孔(稀釋倍數(shù)從103到107);第2天吸去細(xì)胞中含有病毒的培養(yǎng)液,加入2mL新鮮的完全培養(yǎng)液,繼續(xù)37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%飽和濕度培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。

② 篩選HepG2細(xì)胞:HepG2細(xì)胞分別在0、5、10、50和100 μg/mL鹽酸四環(huán)素(tetracycline,TET)情況下處理24 h后,采用CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活性,以確定TET的半致死濃度;熒光顯微鏡下,通過載體報(bào)告子GFP檢測(cè)感染效率,然后以TET的半致死濃度處理感染效率為50%以上的HepG2細(xì)胞數(shù)次;篩選出STAT6-ORF以及STAT6-RNAi的穩(wěn)定表達(dá)HepG2細(xì)胞,并以1/2半致死量的TET維持培養(yǎng)。

③CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性:按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。

1.2.2 STAT6表達(dá)檢測(cè)

①RT-PCR檢測(cè):細(xì)胞按1×106密度接種于六孔板培養(yǎng),經(jīng)處理后去上清,每孔加入1m L Trizol,靜置5min充分裂解(Trizol變粘稠)后吸到1.5 mL EP管中,或液氮速凍后-80℃保存?zhèn)溆?加Trizol1/5體積(200μL)的氯仿劇烈振蕩,室溫靜置5min,4℃,12 000 g離心15 min;將上清移到新EP管,加等體積(500 μL)異丙醇混勻,室溫靜置10min,4℃,12 000 g離心10min;棄上清,500μL 75%乙醇洗滌;4℃,12 000 g離心2min,重復(fù)1次;空甩一次(常溫12 000 g離心1min);超凈臺(tái)內(nèi)把柱子蓋打開吹1～2min,將柱子放到新的1.5mLEP管;加入10～40μLDEPC水(依材料多少而稀釋),62℃2min,常溫12 000 g離心1min,管內(nèi)即為RNA。取1μL分光光度計(jì)(eppendorf,AG)檢測(cè)純度和濃度,1μL進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)其完整性,余下部分立即保存于-80℃超低溫冰箱中,或立即用于反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)根據(jù)Primer Script TMRT-PCR試劑盒步驟進(jìn)行操作。

用于RT-PCR反應(yīng)引物與條件如下:基因STAT6,檢測(cè)長(zhǎng)度880 bp,反應(yīng)條件94℃,5 min;94℃,30 s,55℃,30 s,72℃,1 min,38 cycles;72℃,8min?；騁APDH,檢測(cè)長(zhǎng)度385 bp,反應(yīng)條件94℃,5 min;94℃,30 s,55℃,30 s,72℃,30 s,30 cycles;72℃,8min

② Western blot檢測(cè)

a.總蛋白提取:將各組細(xì)胞用胰酶消化,預(yù)冷PBS緩沖液沖洗3次,將細(xì)胞置于冰上,放置30min,加裂解液100μL充分裂解細(xì)胞。收集混合液至1.5 m LEP管中,12 000 g,4℃離心20 min。收集上清液,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

b.蛋白定量:采用BCA Protein Assay Reagent Kit進(jìn)行定量。將A液和B液(50∶1)混合,室溫放置30min后,取200 L混合液加入至96孔板中,然后加入不同濃度的BSA標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣品10μL(1∶10稀釋),空白孔中加入雙蒸水10μL調(diào)零。37℃孵育30min后,多功能酶標(biāo)儀測(cè)定在570 nm處的吸光度值(OD值),以標(biāo)準(zhǔn)品的OD值繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白濃度,以保證上樣量一致。

c.蛋白電泳:按分子生物學(xué)試驗(yàn)指南制備分離膠和濃縮膠,經(jīng)BCA蛋白定量檢測(cè)后,待測(cè)蛋白的上樣濃度為100μg/mL。根據(jù)目的蛋白分子量的大小,選擇合適濃度的聚丙烯酞胺凝膠電泳。上層濃縮膠濃度為8%,下層分離膠濃度為3%。用上樣Buffer稀釋蛋白樣品,100℃水浴煮沸30 min,冰上放置2 min。每泳道上樣30μL蛋白樣品,80 V恒壓跑出濃縮膠,120 V恒壓至溴酚蘭剛好跑出分離膠。

d.G250染色判斷蛋白樣品質(zhì)量:卸去膠板,將凝膠置于G250染色液中,室溫染色2 h后,放入脫色液中脫色,并掃描電泳結(jié)果,從中選擇能跑出條帶完整清晰的樣品(如圖2),然后調(diào)整上樣量(保證蛋白上樣量一致)進(jìn)行跑膠,轉(zhuǎn)膜等后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

e.半干式電轉(zhuǎn)印跡:蛋白電泳結(jié)束后,取出凝膠,在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡30min。按凝膠的大小比例剪好PVDF膜,置于甲醇中浸泡15min;同時(shí)按同樣大小比例裁剪干轉(zhuǎn)的厚濾紙,置于轉(zhuǎn)移緩沖液中浸潤(rùn)30min。按順利放置厚濾紙,PVDF膜,凝膠,厚濾紙至半干槽中,并用玻棒趕去每層的氣泡。蓋好金屬板,再加上陽(yáng)極電極板進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)移條件:穩(wěn)壓8 V室溫轉(zhuǎn)27min(得到較多質(zhì)量＞72KD的蛋白),或8 V穩(wěn)壓17min(得到較多質(zhì)量＜72KD的蛋白),或者穩(wěn)壓8 V室溫轉(zhuǎn)23min。

f.免疫染色:取出轉(zhuǎn)移后的PVDF膜,用1×TBST潤(rùn)濕后,置于5%脫脂奶粉,37℃封閉1 h;

用抗體buffer稀釋一抗(1∶500),置于雜交袋與PVDF膜進(jìn)行一抗反應(yīng),4℃封閉過夜;取出PVDF膜,1×TBST洗滌,5 min,3次;PVDF膜與生物素化的二抗反應(yīng)(二抗用抗體buffer稀釋5 000倍),37℃雜交1.5 h;1×TBST洗滌PVDF膜,10min,2次;辣根過氧化物酶-ECL法進(jìn)行檢測(cè)。

g.顯影定影:按照Pierce公司ECL發(fā)光檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作,將PVDF膜平鋪于保鮮膜上,吸取適量ECL顯色液滴加于膜上,吸去顯色液,迅速用保鮮膜將膜包好后置于暗匣內(nèi),暗房?jī)?nèi)進(jìn)行壓片,避光37℃反應(yīng)30min。膠片進(jìn)行顯影和定影后,掃描記錄。

1.2.3 CCK-8法檢測(cè)HepG2細(xì)胞的增殖能力:實(shí)驗(yàn)分為4組:空白對(duì)照組(未經(jīng)處理的 HepG2細(xì)胞)、陰性對(duì)照組(只感染pLVTHm空病毒)、感染 pLVTHm-STAT6-RNAi組、感染pLVTHm-STAT6-ORF組。將不同組HepG2細(xì)胞接種于96孔板(100μL/孔),置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng),光學(xué)顯微鏡下觀察并記錄細(xì)胞的形態(tài)。分別于24、48、72和96 h后(細(xì)胞培養(yǎng)24 h左右進(jìn)行傳代),加入10μL/孔的CCK-8溶液,操作時(shí)注意不要孔中生成氣泡,因?yàn)闅馀輹?huì)折光影響OD值。

按CCK-8試劑盒說(shuō)明書提供的方法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性,將培養(yǎng)板置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育1.5 h,多功能酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)在450 nm處的吸光度值(OD值),以此反映細(xì)胞增殖活性。

1.2.4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HepG2細(xì)胞的遷移能力:實(shí)驗(yàn)分為4組:空白對(duì)照組(未經(jīng)處理的HepG2細(xì)胞)、陰性對(duì)照組(只感染 pLVTHm空病毒)、感染 pLVTHm-STAT6-RNAi組、感染pLVTHm-STAT6-ORF組。在 Transwell上室的聚碳酸酯膜(polycarbonate membrane,PC,直徑6.5 mm)上,加入稀釋后的Matrigel(3.9μg/μL)60～80μL,37℃反應(yīng)30min使 Matrigel聚合成凝膠。在Transwell下室中加入DMEM完全培養(yǎng)液600μL。用無(wú)血清培養(yǎng)液將待檢細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,每組細(xì)胞設(shè)3孔。在上室孔中準(zhǔn)確加入細(xì)胞1×105個(gè)/孔,每孔100～200μL,置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0、24、48和72 h后。棄去上室液體,小心取出上室,用濕棉簽輕輕拭去膜上面未穿過膜的細(xì)胞。麗春紅染色30min,多余染液沖洗干凈后將膜雙側(cè)封固,80℃烤干。倒置顯微鏡(250倍)下直接計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 總RNA濃度和純度鑒定結(jié)果 各組細(xì)胞總RNA濃度和純度測(cè)定結(jié)果見表1。電泳結(jié)果見圖1。28s和18s條帶完整,可以進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

表1 各組細(xì)胞總RNA濃度和純度測(cè)定Tab.1 Each cell concentration and total RNA purity determination

圖1 各組總RNA電泳圖Fig.1 Total RNA electrophoresis results in each group

2.2 RT-PCR和Western Blot檢測(cè)STAT6的表達(dá) RT-PCR結(jié)果顯示:STAT6-RNAi細(xì)胞中未檢測(cè)到 STAT6(見圖 2)。Western Blot結(jié)果顯示:STAT6-RNAi細(xì)胞中STAT6表達(dá)明顯下調(diào)(見圖3)。說(shuō)明STAT6-RNAi轉(zhuǎn)染成功。

圖2 RT-PCR檢測(cè)慢病毒感染后HepG2細(xì)胞中STAT6的表達(dá)Fig.2 Rt-PCR reaults of STAT6 expression in HepG2 cells after infected with slow virus

圖3 Western Blot檢測(cè)慢病毒感染后HepG2細(xì)胞中STAT6的表達(dá)Fig.3 Western Blot results of STAT6 expression in HepG2 cells after infected with slow virus

2.3 CCK-8法檢測(cè)HepG2細(xì)胞增殖 光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞表型的改變,STAT6基因被干擾后,細(xì)胞逐漸崩解、漂浮死亡(見圖4);而過表達(dá)STAT6的HepG2細(xì)胞增殖加快,從第2代開始,細(xì)胞的增殖速度明顯提高。CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染STAT6-RNAi的HepG2細(xì)胞活性從第2代開始下降,第3代和第4代均顯著低于第1代(F=102.984,P＜0.001,)。而過表達(dá)STAT6-ORF的HepG2細(xì)胞活性均顯著性升高(F=20.609,P＜0.001,見圖 5)。

圖4 STAT6-ORF和STAT6-RNAi對(duì)慢病毒感染HepG2細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.5 Effects of STAT6-ORF and STAT6-RNAi on celluar morophology of HepG2 cell

圖5 STAT6-ORF和STAT6-RNAi對(duì)慢病毒感染HepG2細(xì)胞增殖活性的影響Fig.5 Effect of STAT6-ORF and STAT6-RNAion HepG2 cell proliferation after infected with slow virus

2.4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HepG2細(xì)胞的遷移能力 正常培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞具有顯著的遷移能力;而STAT6-RNAi轉(zhuǎn)染后,細(xì)胞遷移能力顯著下降(F=136.660,P＜0.01);當(dāng)過表達(dá)STAT6-ORF后,細(xì)胞遷移能力顯著提高(F=576.219,P＜0.01,見圖6)。

圖6 STAT6-ORF和STAT6-RNAi對(duì)慢病毒感染HepG2細(xì)胞遷移的影響Fig.6 STAT6-ORF and STAT6-RNAieffects on HepG2 cellmigration slow virus infection

3 討論

近年來(lái),STAT6信號(hào)通路越來(lái)越受到關(guān)注,研究表明,IL-4/STAT6信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有重要影響。為了深入探討STAT6基因在肝癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能,本研究對(duì)其進(jìn)行RNA干擾和過表達(dá)實(shí)驗(yàn),構(gòu)建細(xì)胞模型,采用慢病毒三質(zhì)粒系統(tǒng)感染肝癌HepG2細(xì)胞,通過TET篩選出能夠穩(wěn)定干擾和過表達(dá)STAT6的HepG2細(xì)胞株,進(jìn)行CCK-8細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn),檢測(cè)分別下調(diào)和上調(diào)STAT6的表達(dá)對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),STAT6被干擾后,細(xì)胞增殖減慢,隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)及傳代,與感染第1代(病毒感染細(xì)胞0 h的細(xì)胞活性)比較,細(xì)胞活性從第2代開始下降,第3代和第4代均顯著低于第1代(F=102.984,P＜0.001),當(dāng)HepG2細(xì)胞傳至第3代時(shí),絕大部分細(xì)胞已經(jīng)死亡,細(xì)胞逐漸崩解、漂浮死亡;而過表達(dá)STAT6的HepG2細(xì)胞增殖加快,從第2代開始,細(xì)胞的增殖速度明顯提高,細(xì)胞活性均顯著性升高(F=20.609,P＜0.001)。實(shí)驗(yàn)表明,STAT6的表達(dá)異常影響肝癌細(xì)胞的增殖能力。同時(shí),結(jié)果表明,正常培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞具有較強(qiáng)的遷移能力;而干擾STAT6表達(dá)后,穿過Transwell上室PC膜的細(xì)胞數(shù)量明顯減少,細(xì)胞的遷移能力顯著性下降(F=136.660,P＜0.01);當(dāng)過表達(dá)STAT6后,細(xì)胞的遷移能力顯著提高(F=576.219,P＜0.01),表明STAT6表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞的遷移能力有重要影響。綜上所述,本文通過干擾和過表達(dá)STAT6,證實(shí)了該基因在肝癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能,直接影響肝癌的發(fā)生、發(fā)展。本研究中構(gòu)建的STAT6-RNAi和STAT6-ORF穩(wěn)定株,方便于后期建立動(dòng)物模型,進(jìn)行裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn),體內(nèi)驗(yàn)證STAT6的生物學(xué)功能,證實(shí)該基因的臨床意義。在此基礎(chǔ)上,便于進(jìn)一步研究STAT6促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖及遷移的分子機(jī)制。

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(編校:吳茜)

Construction of stably transfected STATb-RNAi in HepG2 and identification of its function

ZHANG Yu-shan1,GAO Guo-sheng2

(1.Department of Infection,Nanyang Central Hospital,Nanyang 473000,China;2.Departmen of Liver Infectious,Ningbo Disease hospital,Ningbo 315000,China)

Objective To explore the effect of RNAi lentivirus vector on stability HepG2 cell proliferation,migration.Methods The virus infected the HepG2 cells stablywere divided into four groups:controlgroup(untreatment),negative controlgroup(infected with PLV-control vector),pLVTHm-STAT6-RNAi group,and pLVTHm-STAT6-ORF goup.Expressing STAT6-ORF and STAT6-RNAi cell lines stably were obtained,and the STAT6 expression were detected by PCR and Western blot.CCK-8 assay and Transwell assay were used to detect the stably transfected cell lines activity and cell migration ability changes.Results The STAT6-ORF and STAT6-RNAi HepG2 stable expression cell line were obtained successfully by TET screening.Compared with control cells,cell proliferation in STAT6-ORF overexpression group were fast(F=4.279,P=0.021),and had high mobility;and in STAT6-RNAi group,the cell proliferated slowly,with the culture time prolonged and passage to the cells of the third generation(HepG2 most cells have died),the cells gradually disintegrated,floating die,cell activity decreased significantly(F=290.114,P＜0.001),transfer capacity decreased significantly.Conclusion The STAT6-ORF and STAT6-RNAi HepG2 stable expression cell line were obtained successfully,is convenient to establish the animalmodel of late,tumor formation in nudemice,biological functions in vivo validation of STAT6,confirme the clinical significance of the gene.

lentiviral package;STAT6 RNA;interference transfection;HepG2 cells

R36.1

A

1005-1678（2014)06-0051-05

2011年浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生計(jì)劃(2011KYB107)

張玉山，本科，副主任醫(yī)師，研究方向：感染性疾病及肝臟病的臨床研究，E-mail： zhang66286@163.com。