常玉華,李坤

(1.山東省交通醫(yī)院 婦產(chǎn)科,山東 濟(jì)南 250031;2.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科,山東 濟(jì)南 250031)

子癇前期患者胎盤(pán)中m iRNA-1O1和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白ERp44的表達(dá)和意義

常玉華1,李坤2

(1.山東省交通醫(yī)院 婦產(chǎn)科,山東 濟(jì)南 250031;2.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科,山東 濟(jì)南 250031)

目的 探討子癇前期患者胎盤(pán)中miRNA-101和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白ERp44的表達(dá)和意義。方法 選取2013年5月～2014年5月入住山東省交通醫(yī)院分娩的100例產(chǎn)婦的胎盤(pán)絨毛組織，隨機(jī)均分為對(duì)照組和子癇前期組，每組各50例。采用RT-PCR法檢測(cè)各組胎盤(pán)組織中miRNA-101的表達(dá)情況；Western blot法檢測(cè)過(guò)表達(dá)和封閉miRNA-101后，各胎盤(pán)組織ERp44的表達(dá)情況；采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果 與對(duì)照組相比，子癇前期組中miRNA-101的表達(dá)明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)。在滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo中過(guò)表達(dá)miRNA-101后，ERp44的表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05)；封閉miRNA-101后，ERp44的表達(dá)上調(diào)（P＜0.05)；過(guò)表達(dá)miRNA-101，細(xì)胞凋亡數(shù)量減少；封閉miRNA-101，細(xì)胞凋亡數(shù)量增加。結(jié)論 子癇前期中，miRNA-101可通過(guò)調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白ERp44的表達(dá)來(lái)調(diào)控胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡過(guò)程。

miRNA-101；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白ERp44；滋養(yǎng)細(xì)胞；子癇前期

子癇前期(preeclapmpsia,PE),是一種十分常見(jiàn)的妊娠并發(fā)癥,其發(fā)病率約為3%～5%［1-2］,臨床表現(xiàn)以蛋白尿和高血壓為主,并伴有周身小血管痙攣和多臟器損傷,是造成圍生期母嬰死亡的主要原因之一［3-5］。目前,對(duì)于子癇前期的病因及發(fā)病機(jī)制并不十分清楚,臨床上通常采用解除血管痙攣和降血壓等對(duì)癥治療,但其預(yù)后并不理想。在以往的治療病例中發(fā)現(xiàn),子癇前期多發(fā)生在妊娠20周胎盤(pán)功能成熟后,而當(dāng)患者娩出胎盤(pán)后,與子癇前期相關(guān)的各種癥狀得以迅速緩解［6-7］。表明子癇前期可能是一種胎盤(pán)相關(guān)性疾病。胎盤(pán)作為妊娠的天然屏障,在妊娠過(guò)程中起著十分重要的作用。胎盤(pán)主要功能細(xì)胞是滋養(yǎng)細(xì)胞,它是胚胎與母體直接接觸的部分,能夠產(chǎn)生細(xì)胞粘附分子,趨化因子等,從而保證妊娠的正常進(jìn)行［8-9］。近年來(lái)研究表明,胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞發(fā)生凋亡與子癇前期的發(fā)病密切相關(guān),而滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡主要與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡途徑有關(guān)［10-11］。正常情況下,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可使機(jī)體免受損傷,但當(dāng)應(yīng)激過(guò)強(qiáng)時(shí)則會(huì)激活某些與細(xì)胞凋亡相關(guān)的信號(hào)通路,使細(xì)胞發(fā)生程序性死亡［12-13］。因此胎盤(pán)中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激與子癇前期的發(fā)病密切相關(guān)。研究表明,子癇前期患者胎盤(pán)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中ERp44蛋白、ERp60蛋白和蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)的現(xiàn)象,其中ERp44蛋白的表達(dá)高出正常孕婦的數(shù)倍,表明ERp44蛋白與子癇前期的發(fā)病密切相關(guān)［14-15］。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類(lèi)廣泛存在于真核生物中的非編碼單鏈RNA分子,可通過(guò)抑制靶mRNA的翻譯,調(diào)控目的基因的表達(dá),達(dá)到調(diào)控細(xì)胞分化、增殖和凋亡的目的。因此內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白ERp44的表達(dá)很可能也受到miRNA的調(diào)控。本研究旨在通過(guò)檢測(cè)子癇前期孕婦和正常孕婦胎盤(pán)組織中miRNA和ERp44的表達(dá)情況,探討miRNA-101與ERp44在子癇前期滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 一般資料 隨機(jī)選取2013年5月～2014年5月入住山東省交通醫(yī)院分娩的100列產(chǎn)婦的胎盤(pán)絨毛組織,對(duì)照組和子癇前期組各50例,年齡24～29歲,平均(26±2)歲,2組年齡無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。所有標(biāo)本均在受試者知情同意后收集,除患者簽署知情同意書(shū)外還得到醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn):①有先天性遺傳性疾病;②有子宮肌瘤等婦科疾病;③多胎;④有其他妊娠期并發(fā)癥;⑤有高血壓、心臟病,腎炎等原有基礎(chǔ)病。

1.2 材料

1.2.1 標(biāo)本取材:所有標(biāo)本均取自分娩后近臍帶部位的無(wú)鈣化和無(wú)壞死的絨毛組織。標(biāo)本取材后用PBS淋洗3次,于離體20min之內(nèi)取新鮮組織60mg,立刻凍存于-72℃冰箱。在2h之內(nèi)提取所有標(biāo)本的總RNA,然后立刻逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,再置于-20℃冰箱保存。

1.2.2 細(xì)胞及試劑:HTR-8/SVneo人滋養(yǎng)細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所)。TrizolRNA試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司),M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(美國(guó)NEB公司),5U/μLTaqDNA聚合酶(廣州東盛生物科技有限公司),ERp44單克隆抗體(DAKO公司,美國(guó)),羊抗兔二抗(北京中衫金橋公司,中國(guó)),miRNA-101 mimics、miRNA-NCinhibitor、anti-miRNA-NCinhibitor和 antimiRNA-101均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 人滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo培養(yǎng)和處理:HTR-8/SVneo細(xì)胞用含10%胎牛血清、青霉素1×105IU/L、鏈霉素100mg/L的DMEM高糖培養(yǎng)基于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞融合到85%左右時(shí),用0.25%胰酶消化,以5×105的密度接種于6孔板,培養(yǎng)24h待細(xì)胞貼壁。

1.3.2 RT-PCR法檢測(cè)2組胎盤(pán)組織中miRNA-101的表達(dá):采用 Trizol法提取離體胎盤(pán)組織細(xì)胞的RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA。具體實(shí)驗(yàn)操作按照RT-PCR試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行,反應(yīng)體系為50μL,94℃下先預(yù)變性4min,然后按照94℃,30s;60℃,60s;72℃,120s,進(jìn)行30個(gè)循環(huán),最后72℃下延伸10min。取RT-PCR的產(chǎn)物10uL進(jìn)行電泳,相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)采用pucMix Marker,使用凝膠掃描系統(tǒng)掃描目的基因和β-actin基因的光密度值,目的基因光密度與β-actin基因光密度的比值反映該目的基因mRNA的表達(dá)水平。

1.3.3 Westernblot法檢測(cè)過(guò)表達(dá)和封閉miRNA-101對(duì)ERp44蛋白表達(dá)的影響:HTR-8/SVneo人滋養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板。過(guò)表達(dá) miRNA-101:細(xì)胞轉(zhuǎn)染 miRNA-101mimics增強(qiáng)劑(miRNA-NCinhibitor抑制劑為陰性對(duì)照);封閉miRNA-101:細(xì)胞轉(zhuǎn)染anti-miRNA-101抑制劑(anti-miRNA-NCinhibitor為陰性對(duì)照)48h后進(jìn)行過(guò)表達(dá)和干擾效率檢測(cè)。收集細(xì)胞,然后提取各組細(xì)胞蛋白。取煮沸后的蛋白質(zhì)樣品用SDS-PAGE電泳分離,然后轉(zhuǎn)移至Millipore膜。用脫脂奶粉封閉1h后,用ERp44單克隆抗體4℃孵育過(guò)夜,緊接著用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗37℃孵育,采用ECL放射自顯影法。最后將膠片掃描,分析目標(biāo)帶的分子量和光密度值,β-actin作為內(nèi)參對(duì)照,2者光密度比值即為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)經(jīng)轉(zhuǎn)染的HTR-8/SVneo細(xì)胞凋亡:HTR-8/SVneo人滋養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后,用0.25%胰酶消化,4℃下離心5min,棄去上清,加10μLAnnexinVFITC熒光探針和5μL的碘化丙錠,避光室溫孵育20min。流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件,正態(tài)計(jì)量數(shù)據(jù)以“±s”表示,2組間的資料比較采用t檢驗(yàn),相關(guān)分析采用Pearson法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組胎盤(pán)組織中miRNA-101的表達(dá)比較 RT-PCR結(jié)果顯示:子癇前期組和正常對(duì)照組的產(chǎn)婦胎盤(pán)中miRNA-101的相對(duì)表達(dá)量分別為(0.41±0.02)和(0.82±0.03),2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05,見(jiàn)圖1)。

圖1 RT-PCR檢測(cè)2組miRNA-101的表達(dá)Fig.1 TheexpressionofmiRNA-101intwogroupstestedbyRT-PCR

2.2 在HTR-8/SVneo細(xì)胞過(guò)表達(dá)和抑制miRNA-101后對(duì)ERp44蛋白表達(dá)的影響 Westernblot結(jié)果顯示:過(guò)表達(dá)miRNA-101組中ERp44的表達(dá)顯著下調(diào),是轉(zhuǎn)染miRNA-101NC組的數(shù)十倍;而轉(zhuǎn)染anti-miRNA-101組中的ERp44表達(dá)也高于轉(zhuǎn)染anti-miRNANC組(見(jiàn)圖2、表2)。說(shuō)明子癇前期患者胎盤(pán)組中的miRNA-101基因表達(dá)與ERp44蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān),miRNA-101可能通過(guò)調(diào)控ERp44的表達(dá)在子癇前期的發(fā)病中起著一定的作用。

圖2 過(guò)表達(dá)和抑制miRNA-101基因后對(duì)ERp44蛋白表達(dá)的影響Fig.2 EffectofoverexpressionorinhibitionofmiRNA-101onERp44expression

表2 各組ERp44蛋白表達(dá)比較Tab.2 Comparison of ERp44 expression in each group

2.3 miRNA-101對(duì)HTR-8/SVneo細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示:在HTR-8/SVneo人滋養(yǎng)細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miRNA-101,細(xì)胞凋亡顯著減少;封閉miRNA-101表達(dá)后,細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著增加(見(jiàn)圖3)。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)mi RNA-101對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡的作用A:miRNA-NC;B:miRNA-101 mimics;C:anti-miRNA NC;D:anti-miRNA-101Fig.3 Effect ofmiRNA-101 on apoptosis of trophoblast cells tested by flow cytometryA:miRNA-NC;B:miRNA-101 mimics;C:anti-miRNA NC;D:anti-miRNA-101

3 討論

微小RNA是近幾年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)廣泛存在的非編碼單鏈RNA分子,由19～25個(gè)核苷酸構(gòu)成［16］。miRNA能夠通過(guò)對(duì)靶mRNA的抑制和降解作用,對(duì)目的基因的轉(zhuǎn)錄翻譯進(jìn)行調(diào)控,從而進(jìn)一步調(diào)控細(xì)胞分化、增殖和凋亡［17］。研究表明,miRNA可以參與機(jī)體許多重要的生理病理過(guò)程。近年來(lái),其對(duì)子癇前期中滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用成為研究的熱點(diǎn)［18］。有文獻(xiàn)報(bào)道,子癇前期的發(fā)生涉及到很多miRNAs的異常表達(dá),在許多重度子癇前期患者中,miRNA都出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)的現(xiàn)象。本研究通過(guò)對(duì)50例子癇前期和50例正常妊娠的孕婦胎盤(pán)組織中miRNA-101的水平檢測(cè),發(fā)現(xiàn)子癇前期患者miRNA-101的表達(dá)顯著性低于正常對(duì)照組,表明miRNA-101可能參與了子癇前期的發(fā)病過(guò)程。

子癇前期往往伴隨著滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡,而滋養(yǎng)細(xì)胞是母體與胚胎直接接觸的部分,是胎盤(pán)的主要功能細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)miRNA-101會(huì)使得滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡數(shù)目顯著減少,而封閉miRNA-101的表達(dá)則可促使滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡。研究說(shuō)明,胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞發(fā)生凋亡與子癇前期的發(fā)病密切相關(guān),而滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡主要與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡途徑有關(guān)。一般正常情況下,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可使機(jī)體免受損傷,但當(dāng)應(yīng)激過(guò)強(qiáng)時(shí)則會(huì)激活某些與細(xì)胞凋亡相關(guān)的信號(hào)通路,使得細(xì)胞發(fā)生程序性死亡。本研究還顯示miRNA-101的表達(dá)與ERp44的表達(dá)呈負(fù)相關(guān),說(shuō)明miRNA-101可能通過(guò)調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白ERp44的表達(dá)參與子癇前期的發(fā)病。

綜上所述,在子癇前期中,miRNA-101表達(dá)下調(diào)可使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白ERp44的表達(dá)增加。下一步將對(duì)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白ERp44的表達(dá)增加相關(guān)的信號(hào)通路進(jìn)行研究,探討促使胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制。

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(編校:吳茜)

m iRNA-1O1 regulates apoptosis of trophoblast cells in preeclampsia by targeting endoplasm ic reticulum protein 44

CHANG Yu-hua1,LIKun2

(1.Department of Obstetrics and Gynecology,Traffic Hospital of Shandong Province,Ji'nan 250031,China;2.Department of Obstetrics and Gynecology,Affiliated Hospital of Shandong Province Academy of Medical Sciences,Ji'nan 250031,China)

Objective To explore the possiblemechanism ofmiRNA-101 regulates endoplasmic reticulum protein ERp44 and apoptosis of placental trophoblast in preeclampsia.Methods 100 cases experimental object from May 2013 to May 2014 in our hospital was selected and divided into two groups.ThemiRNA-101 expression in two groups were detected by RT-PCR.ERp44 expression were detected by western blot when overexpressed and inhibited miRNA-101.At the same time,the number of cell apoptosis was tested by Flow cytometry.Results Compared with control group,the expression ofmiRNA-101 in PE group were decreases(P＜0.05).The level of ERp44 was elevated and the number of cell apoptosis reduced after miRNA-101 overexpression;the level of ERp44 was declined and the number of cellapoptosis increased after inhibite the expression ofmiRNA-101(P＜0.05).Conclusion mi RNA-101 regulates apoptosis of trophoblast cells by regulating the expression of ERp44 in patientswith preeclampsia.

miRNA-101;endoplasmic reticulum protein 44;trophoblast cells;preeclampsia

R714.245

A

1005-1678（2014)06-0038-04

山東省自然科學(xué)基金(ZR2009CL027)；山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)基金(201023)

常玉華，女，本科，主治醫(yī)師，研究方向：婦產(chǎn)科學(xué)，E-mial：qch1821460008@163.com。