白艷香,劉馨

(1.遼寧醫(yī)學(xué)院 研究生學(xué)院,遼寧 錦州 121001;2.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 檢驗(yàn)科,遼寧 錦州 121001)

玉米油對2型糖尿病胰島素抵抗大鼠葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4 m RNA表達(dá)的影響

白艷香1,劉馨2△

(1.遼寧醫(yī)學(xué)院 研究生學(xué)院,遼寧 錦州 121001;2.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 檢驗(yàn)科,遼寧 錦州 121001)

目的 通過檢測玉米油對2型糖尿病胰島素抵抗大鼠葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（glucose transporter 4，GLUT-4)mRNA表達(dá)的影響，研究玉米油改善2型糖尿病大鼠胰島素抵抗的作用機(jī)制。方法 采用高脂高糖飼料及小劑量鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ)建立2型糖尿病胰島素抵抗大鼠模型。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、玉米油低劑量組（0.5mg/kg)、玉米油高劑量組（1.0mg/kg)和羅格列酮組，分別連續(xù)灌胃相應(yīng)試劑。6周后，采用葡萄糖氧化酶法測定各組大鼠空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG)水平，RT-PCR法測定GLUT-4mRNA表達(dá)。結(jié)果 與模型組相比，玉米油低劑量組和高劑量組大鼠血糖水平明顯降低，GLUT-4mRNA表達(dá)明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)。結(jié)論 玉米油可通過增加2型糖尿病大鼠GLUT-4 mRNA的表達(dá)來改善胰島素抵抗，從而使血糖降低。

玉米油；2型糖尿?。灰葝u素抵抗；葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4

2型糖尿病(type 2 diabetesmellitus,T2DM)是老年人最常見的慢性疾病之一,由于人們生活方式的改變和社會(huì)人口老齡化,2型糖尿病患者的數(shù)量正呈現(xiàn)全球性的增長趨勢［1］。其病因與胰島素抵抗和胰島素分泌不足有關(guān),但部分患者并非胰島素產(chǎn)生不足,而是由于胰島素的作用效果減弱所致。其中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(glucose transporters 4,GLUT-4)表達(dá)減弱是胰島素抵抗產(chǎn)生的重要環(huán)節(jié)［2］。本實(shí)驗(yàn)室之前的研究已經(jīng)證實(shí)玉米油能夠有效改善2型糖尿病大鼠的胰島素抵抗情況［3］,本文旨在通過檢測玉米油對2型糖尿病胰島素抵抗大鼠GLUT-4mRNA的表達(dá)水平,探討玉米油改善2型糖尿病大鼠胰島素抵抗的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:健康SD雄性大鼠50只,體質(zhì)量(200±20)g,購自遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號(hào):LY20131022。

1.1.2 試劑和儀器:玉米油(山東三星玉米產(chǎn)業(yè)科技有限公司);鏈脲佐菌素(美國Sigma),臨用前以pH 4.5、0.1mol/L枸櫞酸鈉緩沖液配成1.25%的溶液;羅格列酮片(貴州圣濟(jì)堂制藥有限公司,批號(hào):20080702);瓊脂糖(Promega公司);RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0試劑盒、DNA Ladder Marker 100均為TaKaRa公司產(chǎn)品;總 RNA提取試劑 Trizol、焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate,DEPC)均為美國Gibco公司產(chǎn)品。

ONE-TOUCH血糖儀(美國強(qiáng)生公司);Thermo NanoDrop 2000核酸蛋白定量儀(美國);BIO-RAD S1000 Thermal Cycler(美國);Gene Genius凝膠成像分析系統(tǒng)(英國Gene公司);D-78532離心機(jī)(德國 Tuttlingen);MIAS-2000型凝膠成像分析系統(tǒng);Eppendorf Bio Photometer(德國);DY9-Ⅱ型電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 造模:按白艷香等［3］方法進(jìn)行造模。50只SD大鼠用普通飼料喂養(yǎng)1周后,稱體質(zhì)量。按照隨機(jī)原則抽取其中8只大鼠作為正常對照組(A組),普通飼料喂養(yǎng),剩余的32只給予高糖、高脂飲食(常規(guī)飼料66.5%,豬油10%,膽固醇2.5%,蔗糖20%,膽酸鹽1.0%)。4周后,按30mg/kg的劑量一次性尾靜脈注射STZ溶液。正常組注射等體積的0.1mmol/L枸櫞酸鈉溶液。1周后,通過尾靜脈采血測定隨機(jī)血糖,以隨機(jī)血糖大于16.7mmol/L為造模標(biāo)準(zhǔn),血糖不達(dá)標(biāo)的重復(fù)上述步驟,3次仍不達(dá)標(biāo)的大鼠不參與本實(shí)驗(yàn)。取造模成功的32只大鼠參加下一步實(shí)驗(yàn)。本次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均嚴(yán)格遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)條例》。

1.2.2 分組給藥:將造模成功后的32只大鼠隨機(jī)分為B、C、D、E 4組,每組各8只。繼續(xù)給予高糖、高脂飲食。B組為糖尿病模型組,每天用和其余組相同體積的生理鹽水灌胃;C組為玉米油低劑量組,每天按0.5 mg/kg的玉米油灌胃;D組為玉米油高劑量組,每天按1.0 mg/kg的玉米油灌胃;E組為羅格列酮組(陽性對照組),每天用30 mg/kg的羅格列酮灌胃。A組繼續(xù)用普通飼料喂養(yǎng)。6周后每組隨機(jī)選取6只大鼠進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測。

1.2.3 引物設(shè)計(jì):根據(jù)GenBank公布的大鼠GLUT-4和βactin基因序列,利用生物軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)引物,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。GLUT-4上游引物:5’-AGCCAGCCTACGCCACCATAG-3’(GenBank收錄號(hào):D28561),下游引物:5’-GGACCCATAGCATCCGCAAC-3’;β-actin 上游引物(GenBank收錄號(hào):NM-031144)5’-ATGCCATCCTGCGTCTGGACCTGGC-3’,下 游 引 物:5’-AGCATTTGCGGTGCACGATGGAGGG-3’。

1.2.4 指標(biāo)檢測

①血糖檢測:取血前大鼠禁食12h,但不禁水。采用葡萄糖氧化酶法用血糖儀測定大鼠空腹血糖。

②大鼠肌肉組織GLUT-4的mRNA基因檢測:各組大鼠采用乙醚吸入麻醉后,暴露大鼠左后腿肌肉,剪取200g大腿肌置于液氮中冷凍,-80℃保存?zhèn)溆谩２捎肨rizol提取總RNA,按照RT試劑盒要求逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,然后取1μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板在20μL體系中進(jìn)行PCR擴(kuò)增,GLUT-4和β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物長度為分別為379bp和606 bp。PCR反應(yīng)時(shí)將引物GLUT-4和βactin置于一管中進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min;94℃,30 s;56.5℃,30s;72℃,50 s,共30個(gè)循環(huán),72℃再延伸10 min。PCR結(jié)束后將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳,然后用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照,并利用圖像分析軟件Gene Tools分析結(jié)果。用GLUT-4和β-actin條帶的吸光度比值作為GLUT-4的相對表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,正態(tài)計(jì)量數(shù)據(jù)以“±s”表示,組間比較采用t檢驗(yàn),以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組GLUT-4 mRNA表達(dá)比較 RT-PCR結(jié)果顯示:與正常組相比,模型組骨骼肌GLUT-4 mRNA表達(dá)水平明顯降低(P＜0.01);與模型組相比,玉米油低劑量、高劑量組以及羅格列酮組的骨骼肌GLUT-4 mRNA表達(dá)水平均明顯升高(P＜0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中玉米油高劑量組升高幅度最大,與正常組最接近(見表1、圖1)。

表1 各組大鼠GLUT-4 mRNA相對表達(dá)量比較Tab.1 Comparison of relative expression of GLUT-4 mRNA in rats in each group

圖1 各組大鼠骨骼肌GLUT-4 mRNA表達(dá)M:Marker;1:正常組;2:模型組;3:玉米油低劑量組;4:玉米油高劑量組;5:羅格列酮組Fig.1 GLUT-4 mRNA expression of rats’skeletalmuscle in each groupM:Marker;1:normal group;2:model group;3:corn oil of low dose group;4:corn oil of high dose group;5:rosiglitazone group

2.2 各組大鼠空腹血糖值比較 空腹血糖測定結(jié)果顯示:與正常組相比,模型組FBG明顯升高(P＜0.01);與模型組相比,玉米油低劑量組、高劑量組及羅格列酮組大鼠血清FBG均明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05,見表2)。

表2 各組大鼠FBG水平(mmol/L)Tab.2 The FBG in rats of each group(mmol/L)

3 討論

糖尿病是全球范圍的公共衛(wèi)生疾病,是威脅人類健康的重大疾病之一。根據(jù)2011年國際糖尿病聯(lián)合會(huì)發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示,2011年2型糖尿病的死亡人數(shù)為460萬,其中20～79歲人群占全球死亡率的8.2%,即每7秒就有1人死亡［4］。2型糖尿病的主要發(fā)病機(jī)制為胰島素抵抗和胰島素分泌不足,正常人體內(nèi)胰島素能夠促進(jìn)葡萄糖的利用,抑制其合成,從而達(dá)到降低血糖的目的。胰島素可以抑制肝糖原轉(zhuǎn)化為葡萄糖并控制其釋放,同時(shí)促進(jìn)外周組織對葡萄糖的利用,故人體的血糖水平在血糖升高的情況下能夠保持在正常水平。2型糖尿病患者由于胰島素抵抗的存在使胰島素不能發(fā)揮正常作用,不能抑制肝糖原的釋放,加上外界刺激從而使血糖水平一直保持在較高狀態(tài),但胰島素與葡萄糖的過量相比處于相對缺乏狀態(tài)［5-6］。

葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4主要分布于脂肪、骨骼肌和心肌組織的細(xì)胞,在未接受刺激的情況下,高于90%的GLUT-4分布于細(xì)胞內(nèi),處于靜息無功能狀態(tài);當(dāng)胰島素刺激時(shí),GLUT-4會(huì)從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)位至細(xì)胞膜上,促進(jìn)葡萄糖順濃度梯度從細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi),是負(fù)責(zé)骨骼肌和脂肪組織攝取葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。而2型糖尿病由于胰島素抵抗的存在,GLUT-4基因表達(dá)減少,不能完成葡萄糖從細(xì)胞外向細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)［7-10］。Jaquet等［7］對13個(gè)出生即有宮內(nèi)發(fā)育遲緩的胰島素抵抗患兒用RT-PCR法檢測肌肉和脂肪組織GLUT-4基因表達(dá)情況,結(jié)果顯示胰島素抵抗的患兒都有不同程度的GLUT-4mRNA表達(dá)下降,表明GLUT-4與胰島素密切相關(guān)。大量研究也證實(shí)GLUT-4是胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要環(huán)節(jié),與胰島素抵抗的產(chǎn)生密不可分［12-15］。

玉米油具有改善2型糖尿病大鼠胰島素抵抗的作用,為探索其作用機(jī)制,本研究通過建立2型糖尿病大鼠胰島素抵抗模型,檢測了給藥前后大鼠骨骼肌葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4mRNA表達(dá)情況。結(jié)果顯示隨著玉米油劑量的增加,大鼠FBG水平明顯降低,GLUT-4 mRNA表達(dá)明顯升高,提示玉米油可能通過增加大鼠GLUT-4 mRNA的表達(dá)來抑制胰島素抵抗,增加骨骼肌和脂肪組織對葡萄糖的吸收,這可能是玉米油改善胰島素抵抗而使血糖降低的主要作用機(jī)制之一。

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(編校:吳茜)

Effect of corn oil on glucose transporters 4 mRNA expression in type 2 diabetes rats w ith insulin resistance

BAIYan-xiang1,LIU Xin2△

(1.Graduate School,Liaoning Medical University,Jinzhou 121001,China;2.Clinical Laboratory,The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University,Jinzhou 121001,China)

Objective To detectmRNA expression of glucose transporters 4(GLUT-4)in type 2 diabetes rats with insulin resistance affected by corn oil,and thus to explain itsmechanism of improvement of insulin resistance.Methods High fat and sugar diet plus low-dose streptozotocin(STZ)were given to establishmodel of type 2 diabetes ratswith insulin resistance,and the ratswere randomly divided intomodel group,corn oil small dosage(0.5 mg/kg)group,corn oil high dosage(1.0 mg/kg)group,and rosiglitazone group.With 6 weeks gavage intervention,fasting blood glucose(FBG)and mRNA of GLUT-4 were detected by glucose oxidasemethod and RT-PCRmethod,respectively.Results Corn oil reduced the level of blood glucose and increase themRNA expression of GLUT-4 in diabetic rats.Conclusion Corn oil could improve insulin resistance,themechanism ofwhich is to increase themRNA expression of GLUT-4,thus lower the blood glucose in type 2 diabetes rats.

corn oil;type 2 diabetes;insulin resistance;blood glucose;glucose transporters 4

R73

A

1005-1678（2014)06-0032-03

遼寧省教育廳資助項(xiàng)目(2013A475)

白艷香，研究生在讀，研究方向：臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)，E-mail：yxbai@126.com；劉馨，通信作者，博士，副教授，副主任檢驗(yàn)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)，E-mail：lyy66112@163.com。