楊春琳 許秀蘭 黃曉麗 劉應(yīng)高

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，雅安，625014)

徐明慶

(攀枝花市東區(qū)林業(yè)局)

劉 韓

(四川省甘孜州林業(yè)科學(xué)研究所)

粗枝云杉(Picea asperata)又名云杉、茂縣云杉、大果云杉以及刺杉等，其適應(yīng)性強(qiáng)，耐寒耐旱，是我國特有樹種，也是我國西南林區(qū)常見的常綠針葉林樹種。粗枝云杉天然林分布在北緯30°00'～35°50'，東經(jīng) 101°～107°，常與多種常綠針葉樹種混生或以單種成林。隨著云杉人工林的大面積推廣與栽植，其所承受的環(huán)境干擾也日趨嚴(yán)重，主要病害有落針病[1－3]、葉銹病[4－5]、葉疫病[6]等，特別是云杉落針病，在四川甘孜州、阿壩州、綿陽以及甘肅[7－12]等地區(qū)尤為嚴(yán)重，已成為高山地區(qū)云杉幼齡林常見的葉部病害，而病原菌對不同葉齡均有侵染作用。就此，本研究以粗枝云杉為研究目標(biāo)，測定并分析其各生理生化指標(biāo)，以期探明發(fā)病云杉的生化變化規(guī)律，為病害有效控制等提供參考依據(jù)。

1 研究地概況

四川省瀘定縣馬廠梁林場為研究地點(diǎn)。該地位于川西地區(qū)，青藏高原東緣，101°46'～102°25'E，29°54'～30°10'N。因其山高、坡陡、谷深，氣候垂直變化較大，海拔2500～3000 m的年均氣溫為8.5℃;海拔1800～2500 m的年均氣溫為11.5℃;海拔1300～1800 m的年均氣溫為14.5℃。山上中部，夏季多雷陣雨，冬季霜雪期可達(dá)4～6個(gè)月。年均降水625 mm，風(fēng)速可達(dá)17 m/s。土壤厚度為50 cm，均為弱酸性土壤。

2 材料與方法

設(shè)置2690、2790 m兩個(gè)海拔樣地，以發(fā)病普遍、病株與健株集中、純林以及標(biāo)準(zhǔn)木等為主要依據(jù)設(shè)立20 m×20 m的標(biāo)準(zhǔn)地。每樣地以不同病級(表1)分別采集當(dāng)年生針葉，每病級重復(fù)采樣3次，做好標(biāo)記，放入冰桶冷藏，帶回測定。3、5、7、10月份進(jìn)行采樣。病情指數(shù)=(∑(代表值×該級植株數(shù))/(總株數(shù)×嚴(yán)重度最高值))×100%。

表1 云杉落針病分級標(biāo)準(zhǔn)

多酚氧化酶(PPO)酶活測定采用鄰苯二酚顯色法[13－14]、過氧化物酶(POD)酶活測定使用愈創(chuàng)木酚顯色法[15]214－216、過氧化氫酶(CAT)酶活測定使用硫代硫酸鈉滴定法[15]217－219、苯丙氨酸解氨酶(PAL)酶活測定使用苯丙氨酸顯色法[16－17]、葉綠素a和葉綠素b質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定采用光密度差值法[18－19]、丙二醛(MDA)質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定采用硫代巴比妥酸顯色法[20－21]，各指標(biāo)測定重復(fù) 3 次。

使用SPSS 20.0和Excel 2007軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。各指標(biāo)間相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性系數(shù)，同時(shí)圖片繪制采用Origin 8.5軟件。

3 結(jié)果與分析

3.1 病情指數(shù)變化

表2顯示，兩海拔云杉病情指數(shù)隨時(shí)間呈“升高—下降—升高”趨勢。3—5月份，2790 m的病情指數(shù)明顯高于2690 m，而后兩者差距逐漸減小，到10月份，2690 m略高于2790 m。說明高海拔比低海拔地區(qū)發(fā)病嚴(yán)重。在3—5月份，隨著病原菌不斷侵入，云杉發(fā)病愈加嚴(yán)重，到5月份時(shí)達(dá)到最大，之后云杉體內(nèi)防御系統(tǒng)發(fā)揮主導(dǎo)作用，使病害有所緩解。7—10月份，寄主的防御體系未能抵擋住病原菌的侵染，從而使病害得以蔓延和發(fā)展。

表2 粗枝云杉幼林落針病病情指數(shù)

3.2 防御酶活性變化

PPO活性:不同海拔云杉針葉內(nèi)PPO活性變化存在差異，且不同病級針葉間也無規(guī)律可尋，特別是病級為0、Ⅰ的針葉。總體來看，2790 m病級為0、Ⅰ的針葉，其PPO活性總體高于2690 m;2690 m病級為Ⅱ、Ⅲ的針葉，其PPO活性則高于2790 m。另外，在侵染后期，病級為Ⅲ的針葉的PPO活性總體高于其他病級的針葉(表3)。

POD活性:由表3可知，不同海拔云杉發(fā)病越嚴(yán)重，其針葉內(nèi)POD活性越高，且2690 m的POD活性總體高于2790 m。說明POD積極參與了云杉落針病的病害防御過程。而在2690 m處，環(huán)境氣候相對緩和，能提高云杉的適合度，在病害發(fā)生初期能夠較早且有效地啟動抗病反應(yīng)，引起體內(nèi)POD活性升高。

表3 粗枝云杉防御酶活性

CAT活性:不同海拔云杉針葉內(nèi)CAT活性變化各異。在2690 m處，CAT活性變化呈“下降—上升”趨勢;在2790 m處，CAT活性變化則呈“上升—下降”趨勢?？傮w而言，云杉發(fā)病越嚴(yán)重，其針葉內(nèi)CAT活性也越高，且2790 m處CAT活性稍高于2690 m，但3月份除外(表3)。

PAL活性:不同海拔云杉針葉內(nèi)PAL活性變化存在差異。在2690 m處，不同病級云杉的針葉內(nèi)PAL活性變化不規(guī)律，而2790 m處其PAL活性變化呈“下降—上升”趨勢，且10月份酶活性稍高。同時(shí)，云杉發(fā)病越嚴(yán)重，其針葉內(nèi)的PAL活性也隨之升高。然而，各海拔間的酶活性大小無明顯差異(表 3)。

3.3 葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化

表4顯示，不同海拔云杉針葉中葉綠素a質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化呈“下降—上升—下降”走勢(2690 m病級Ⅲ和2790 m病級Ⅰ呈“下降—上升”趨勢)。在5月份，總體上葉綠素a質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低，5月可能是病原菌侵染寄主的下限臨界點(diǎn)。在發(fā)病期內(nèi)，葉綠素a質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化無規(guī)律，這或許與寄主的抗性有關(guān)。與葉綠素a不同，葉綠素b質(zhì)量分?jǐn)?shù)在5月份最高，不同海拔云杉針葉中葉綠素b質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈“上升—下降”走勢，但病級較輕的，如2690 m的0、Ⅰ級和2790 m的0級，在感病后期其質(zhì)量分?jǐn)?shù)有所回升。說明發(fā)病期間，葉綠素b積極參與了抗病過程，而葉綠素a則遭到了病原菌的破壞，使前期的質(zhì)量分?jǐn)?shù)迅速減少。不同病級云杉針葉的葉綠素a/b值變化呈“下降—上升”趨勢(2690 m病級為0、Ⅰ和2790 m病級為0的變化呈“下降—上升—下降”趨勢)，且上升后的比值比前期高許多。葉綠素(a+b)質(zhì)量分?jǐn)?shù)除2690 mⅡ級外，其變化則呈“上升—下降”趨勢，且后期質(zhì)量分?jǐn)?shù)均低于前期。此外，云杉發(fā)病越嚴(yán)重，其葉綠素(a+b)質(zhì)量分?jǐn)?shù)越低，總體上，高海拔低于低海拔地區(qū)(表5)。

表4 粗枝云杉葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化動態(tài) mg·g－1

表5 粗枝云杉葉綠素(a/b)和葉綠素(a+b)變化動態(tài)

3.4 MDA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化

由表6可見，各海拔的MDA質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化不同。在2690 m處，不同病級云杉針葉內(nèi)MDA質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈緩慢上升走勢(健康針葉除外)，而2790 m的MDA質(zhì)量分?jǐn)?shù)卻呈“下降”趨勢。這應(yīng)該是由于云杉存在抗性差異所引起?？傮w來看，2790 m的云杉針葉內(nèi)MDA質(zhì)量分?jǐn)?shù)總體高于2690 m;云杉發(fā)病越嚴(yán)重，其針葉內(nèi)MDA質(zhì)量分?jǐn)?shù)也就越高。

3.5 測定指標(biāo)與病情指數(shù)的相關(guān)性

病情指數(shù)與各指標(biāo)間的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)(表7):不同海拔中，其PPO、POD和CAT活性與病級指數(shù)之間相關(guān)性無規(guī)律，這或許與植株抗性強(qiáng)弱有關(guān)。PAL活性與病級指數(shù)間呈負(fù)相關(guān)(2690 m處)，葉綠素a質(zhì)量分?jǐn)?shù)與之負(fù)相關(guān)(2790 m病級為0的除外)，葉綠素b質(zhì)量分?jǐn)?shù)與之正相關(guān)(海拔越高相關(guān)性越強(qiáng))。另外，葉綠素(a/b)變化與病情指數(shù)間呈負(fù)相關(guān)，且2790 m處云杉發(fā)病越嚴(yán)重，其相關(guān)性越高(特別是病級為Ⅱ、Ⅲ的云杉針葉)，而葉綠素(a+b)質(zhì)量分?jǐn)?shù)與病級指數(shù)中度正相關(guān)(2790 m)。MDA質(zhì)量分?jǐn)?shù)與病情指數(shù)間相關(guān)性因海拔不同存在差異，2690 m處為負(fù)相關(guān)(健康針葉除外)，2790 m處為正相關(guān)。

表6 粗枝云杉MDA質(zhì)量分?jǐn)?shù)

不同海拔各指標(biāo)間相關(guān)性分析表明(表8):各防御酶系間相關(guān)性無規(guī)律，特別是PPO與POD活性之間，而有一定相關(guān)性的指標(biāo)，一般相關(guān)系數(shù)不高，多數(shù)存在于病級為Ⅱ、Ⅲ的云杉針葉中，且不同海拔間也存在差異。在2690 m處，病級為Ⅱ、Ⅲ的云杉針葉中，PPO與CAT活性間中度正相關(guān)，POD與PAL活性間負(fù)相關(guān)(病級為Ⅲ的極顯著負(fù)相關(guān))。而葉綠素a與葉綠素b質(zhì)量分?jǐn)?shù)間均負(fù)相關(guān)(病級為0、Ⅱ的顯著負(fù)相關(guān))，葉綠素a與MDA質(zhì)量分?jǐn)?shù)間中度正相關(guān)(在病級為Ⅱ、Ⅲ的云杉針葉中)，而葉綠素b與之相反;在2790 m處，POD與CAT活性間呈中度負(fù)相關(guān)，與葉綠素a質(zhì)量分?jǐn)?shù)間也呈中度負(fù)相關(guān)(病級為Ⅱ、Ⅲ的云杉針葉)。另外，葉綠素a與葉綠素b質(zhì)量分?jǐn)?shù)間負(fù)相關(guān)(病級為Ⅰ的顯著負(fù)相關(guān)，但病級為0的無相關(guān)性)。不論同海拔，葉綠素(a/b)與各指標(biāo)間相關(guān)性多數(shù)較低，且無規(guī)律，同時(shí)2690 m處，葉綠素(a+b)質(zhì)量分?jǐn)?shù)與其他指標(biāo)間也有類似結(jié)果。在2790 m處，葉綠素(a+b)質(zhì)量分?jǐn)?shù)與PAL活性中度負(fù)相關(guān)，與MDA質(zhì)量分?jǐn)?shù)中度正相關(guān)。

表7 粗枝云杉各測定指標(biāo)與病級指數(shù)間的相關(guān)性

表8 粗枝云杉各測定指標(biāo)間的相關(guān)性

續(xù)(表8)

4 結(jié)論與討論

試驗(yàn)前期調(diào)查發(fā)現(xiàn):不同海拔區(qū)域，粗枝云杉發(fā)病程度不同，2590～2700 m，平均發(fā)病率為80.15%，平均病情指數(shù)為 38.26;2700～2900 m，96.55%(50.68);2900～3110 m，97.58%(66.93)。就調(diào)查結(jié)果來看，高海拔比低海拔地區(qū)發(fā)病嚴(yán)重。此外，病原菌一般在5—9月份對云杉進(jìn)行侵染[22]，然而在馬廠梁林場，3月份以前，環(huán)境晝夜溫度多處于冰點(diǎn)以下，這限制了環(huán)境中多數(shù)生物的活動。但從3月初開始，環(huán)境溫度迅速回暖，去年生針葉逐漸脫落并長出子囊果進(jìn)行有性生殖，子囊果漸漸成熟并釋放子囊孢子侵染當(dāng)年生針葉，病原菌的侵染最長可持續(xù)至9月份。

PPO、POD和CAT等酶類是植物體內(nèi)抵抗外界干擾的主要防御酶系[23－25]，而 PAL 在次級抗病產(chǎn)物合成方面有一定作用[26－27]。一般植物在受到外界干擾時(shí)(如病原菌侵染、植食性動物的啃食以及其他環(huán)境脅迫等)，體內(nèi)會迅速積累活性氧成分[28]，如不及時(shí)代謝清除，會影響植株生長甚至使其死亡。試驗(yàn)結(jié)果表明，各防御酶系間協(xié)同作用不強(qiáng)，幾乎每種酶對病原菌的侵染僅單獨(dú)起作用(主要為POD、CAT和PAL)，這不利于體內(nèi)活性氧成分的有效清除，而類似研究發(fā)現(xiàn)，在紫果云杉(P.purpurea)、青杄(P.wilsonii)、川西云杉(P.alfouriana)、青海云杉(P.crassifolia)和粗枝云杉中，粗枝云杉抗落針病能力最弱[29]，而試驗(yàn)從防御酶系間的相互關(guān)系這一角度給予了解釋。MDA作為膜脂過氧化作用的最終產(chǎn)物(活性氧成分引起膜脂過氧化作用)[30]，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)可作為膜脂過氧化水平和生物膜損傷程度的指標(biāo)[31－32]。本試驗(yàn)中，2690 m 處，不同病級云杉針葉中MDA質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈緩慢增加趨勢(健康針葉除外)，而在2790 m處則剛好相反。說明低海拔地區(qū)植物針葉膜脂過氧化作用較嚴(yán)重，高海拔云杉雖然發(fā)病較嚴(yán)重，但機(jī)體具有較高抗病性，因此能夠較有效的清除體內(nèi)一定量的MDA，這也說明植株在逆境中更能誘導(dǎo)抗性的形成。然而，馬廠梁云杉生長并不樂觀，發(fā)病嚴(yán)重的，其2年及以上生針葉甚至1年生針葉大多脫落，樹枝僅剩半年生針葉或芽苞。

葉綠素是植物的光合器官，包括葉綠素a和葉綠素b。當(dāng)植株遭到侵染后，會影響葉綠素的合成，導(dǎo)致葉片退綠或黃化等[33]。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，葉綠素a與葉綠素b質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化呈“此消彼長”，即葉綠素a先降后升，而葉綠素b先升后降。說明機(jī)體通過協(xié)調(diào)兩者，以彌補(bǔ)葉綠素的損失，使其保持穩(wěn)定水平。侵染期，在病原物的刺激下，機(jī)體迅速合成葉綠素b，彌補(bǔ)葉綠素a的損失，使葉綠素含量超過原有水平，而后期，隨著病害加劇，葉綠素a的增加量不足以彌補(bǔ)葉綠素b的損失量，致使葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)迅速降低至較低水平，從而影響葉片光合作用，使其逐漸喪失光合力，直至枯死凋落。另有研究發(fā)現(xiàn)，植物組織中葉綠素(a/b)值變化在選育抗性品種方面具有一定意義[34]。本試驗(yàn)中，發(fā)病嚴(yán)重的云杉針葉內(nèi)葉綠素(a/b)值變化呈“下降—上升”趨勢(2690 m病級為Ⅱ、Ⅲ和2790 m病級為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的針葉)，即3—5月份，其比值迅速減少至最低，5—10月份，急劇上升為起初(3月份)的4～10倍，而發(fā)病較低(2690 m病級為Ⅰ的針葉)和健康植株的葉綠素(a/b)值變化呈“下降—上升—下降”趨勢，其變化幅度不大，基本在較小范圍內(nèi)上下波動。因此，在粗枝云杉的抗病選育中，葉綠素(a/b)值變化具有一定的指導(dǎo)意義。

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