田倩 ，曹海軍 ，曹雅，何澤超，李長清Δ

（1.四川大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，四川 成都 610065；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 輸血研究所，四川 成都 610052）

人凝血酶原復(fù)合物中凝血因子活性測(cè)定的影響因素研究

田倩1，曹海軍2，曹雅1，何澤超1，李長清2Δ

（1.四川大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，四川 成都 610065；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 輸血研究所，四川 成都 610052）

目的探討幾種因素對(duì)人凝血酶原復(fù)合物（prothrombin complex concentrates，PCC）中凝血因子活性測(cè)定的影響。方法參照《中國藥典》（2010版），采用不同樣品前處理、不同稀釋劑、不同鹽離子濃度制品、不同測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品及不同廠家試劑分析其對(duì)PCC中凝血因子II、VII、IX、X活性測(cè)定結(jié)果的影響。結(jié)果PCC加入硫酸魚精蛋白，凝血因子II、VII、X活性降低，凝血因子IX活性升高；樣品37℃溫浴15 min與否，4種因子活性測(cè)定統(tǒng)計(jì)顯示無顯著差異。乏漿、生理鹽水、蒸餾水及配套稀釋液稀釋對(duì)4種因子活性測(cè)定結(jié)果影響統(tǒng)計(jì)顯示有顯著差異（P＜0．05）；含1mol/L氯化鈉的制品，凝血因子II、X活性測(cè)定結(jié)果顯著低于含0．25 mol/L氯化鈉制品（P＜0．05），而凝血因子VII、IX無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。不同標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定的因子活性均不同。不同廠家試劑對(duì)4種凝血因子測(cè)定結(jié)果統(tǒng)計(jì)顯示有顯著差異（P=0．00）。結(jié)論P(yáng)CC前處理?xiàng)l件、測(cè)定稀釋劑、制品所含的鹽離子濃度、測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品及不同廠家的試劑均影響其凝血因子的活性測(cè)定，在檢測(cè)過程中應(yīng)予重視。

凝血酶原復(fù)合物；硫酸魚精蛋白；稀釋劑；鹽離子濃度；標(biāo)準(zhǔn)品

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 PCC（華蘭公司，批號(hào)：201205025）；Coagulation Factor II、VII、IX、X Deficient Plasma（SIEMENS公司，批號(hào)：503620 B、500737 B、500870、504001A）；Thromborel S（SIEMENS 公司，批號(hào)：545503）；Dade Owren’s Veronal Buffer（SIEMENS 公司，批號(hào)：547005）；Actin（SIEMENS公司，批號(hào)：547174 A）；氯化鈣溶液（SIEMENS公司，批號(hào)：539462 A）；FII、FVII、FIX、FX 活性檢測(cè)試劑盒（成都協(xié)和技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)：20130702）；標(biāo)準(zhǔn)品1（SIEMENS公司，批號(hào)：503228 B）；標(biāo)準(zhǔn)品 2（NIBSC，批號(hào)：SSCLOT 4）；標(biāo)準(zhǔn)品3（成都協(xié)和技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)：2013070）；酸魚精蛋白（sigma p 4380），其余試劑為國產(chǎn)分析純。全自動(dòng)血凝儀（CA-1500，Sysmex 公司）；恒溫水浴箱（HH-W 600，金壇市醫(yī)療儀器廠）；純水儀（Milli-Q Advantage，Millipore 公司）。

1.2 方法

1.2.1 硫酸魚精蛋白對(duì)PCC制品4種凝血因子測(cè)定結(jié)果的影響 根據(jù)中國藥典（2010版）[11]，用相應(yīng)因子的乏漿（FIX為生理鹽水稀釋）稀釋PCC制品。配制濃度0.2 mg/mL的硫酸魚精蛋白溶液，按照歐洲藥典[10]規(guī)定肝素鈉在PCC中最大含量中和肝素鈉。分3種情況對(duì)PCC樣品進(jìn)行處理，樣本1加入一定濃度的硫酸魚精蛋白溶液，混勻立即測(cè)因子活性；樣本2不加硫酸魚精蛋白溶液，樣本3加入相同濃度的硫酸魚精蛋白溶液，樣本2和樣本3均在37℃溫浴15 min。采用全自動(dòng)凝血儀測(cè)定4種凝血因子活性。

1.2.2 稀釋劑對(duì)PCC制品4種凝血因子測(cè)定結(jié)果的影響PCC制品分別用相應(yīng)乏漿（FIX用生理鹽水）、配套稀釋液、純水稀釋PCC制品，按照中國藥典（2010版）[11]要求處理樣品后，在全自動(dòng)凝血儀上測(cè)出3種稀釋條件下的4種因子的活性。

1.2.3 不同鹽離子濃度對(duì)PCC制品4種凝血因子測(cè)定結(jié)果的影響 用相應(yīng)的乏漿（凝血因子II、VII、X）和生理鹽水（凝血因子IX）將PCC制品稀釋到一定濃度，加入NaCl，制備鹽離子濃度分別為1 mol/L、0.5 mol/L、0.25 mol/L 3種濃度梯度PCC溶液，同時(shí)使其待測(cè)PCC制品中相應(yīng)的凝血因子濃度滿足中國藥典，檢測(cè)3種鹽離子濃度中4種凝血因子活性。

1.2.4 不同標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)PCC制品四種凝血因子測(cè)定結(jié)果的影響 分別用3種標(biāo)準(zhǔn)品做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品處理方法按照中國藥典（2010版）[11]，測(cè)出3種標(biāo)準(zhǔn)曲線下PCC溶液中4種因子活性。

1.2.5 不同廠家試劑對(duì)PCC制品四種凝血因子測(cè)定結(jié)果的影響 PCC制品處理按照中國藥典（2010版）[11]，分別用2套試劑測(cè)出樣品中4種凝血因子活性。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 凝血儀測(cè)得樣品的凝固時(shí)間，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到樣品因子的百分活性，乘以稀釋倍數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)品的因子活性，即為樣品的因子活性。采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)每種因子3種情況下的18個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。兩公司試劑檢測(cè)結(jié)果采用配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 硫酸魚精蛋白對(duì)FII、FVII、FIX、FX活性測(cè)定的影響SIEMENS公司試劑測(cè)出的因子活性結(jié)果見圖1。PCC制品加硫酸魚精蛋白后FII、FVII、FX的活性較不加偏低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。加硫酸魚精蛋白后，37℃溫浴15 min與否對(duì)4種凝血因子活性無顯著影響。PCC制品加入硫酸魚精蛋白后FIX活性測(cè)定高于不加，加硫酸魚精蛋白后立即測(cè)FIX活性高于加硫酸魚精蛋白且37℃溫浴15 min，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 硫酸魚精蛋白對(duì)4種凝血因子活性的影響*P＜0.05，**P＜0.01，與加硫酸魚精蛋白相比Fig.1 The influence of protamine sulfate on activities of four coagulation factors in three samples*P＜0.05，**P＜0.01， compared with adding protamine sulfate

2.2 稀釋液種類的不同對(duì)FII、FVII、FIX、FX活性測(cè)定的影響 SIEMENS公司試劑測(cè)定結(jié)果見圖2。測(cè)定結(jié)果顯示配套稀釋液稀釋均低于超純水稀釋，2組FII與FVII差異顯著，F(xiàn)IX與FX差異不顯著。乏漿稀釋PCC后，外源因子FII，F(xiàn)VI，F(xiàn)X活性測(cè)定結(jié)果顯示與其它2種稀釋液比較有顯著性差異（*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001）。內(nèi)源因子FIX生理鹽水稀釋后測(cè)出的因子活性高于其他2種稀釋液情況，但與超純水稀釋差異不顯著。

圖2 稀釋液對(duì)4種凝血因子活性測(cè)定的影響*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，與生理鹽水組對(duì)比Fig.2 The influence of dilution buffer on activities of four coagulation factors*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001， compared with normal saline group

2.3 PCC中不同鹽離子濃度對(duì)FII、FVII、FIX、FX活性測(cè)定的影響 SIEMENS試劑盒對(duì)3種不同鹽離子濃度的PCC測(cè)定4種因子活性結(jié)果見圖3。從圖3中可見FIX與FVII在3種鹽離子濃度下測(cè)出的因子活性均無顯著性差異，而FII與FX在低鹽離子濃度下測(cè)出的因子活性高于高鹽離子濃度，通過均值分析顯示差異性顯著（*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001）。

圖3 鹽離子濃度對(duì)4種凝血因子活性測(cè)定的影響*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，與 0.25 mol/L NaCl組相比Fig.3 The influence of salt concentration on activities of four coagulation factors*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001， compared with 0.25 mol/L NaCl group

2.4 標(biāo)準(zhǔn)品的不同對(duì)FII、FVII、FIX、FX活性測(cè)定的影響 用3種不同的標(biāo)準(zhǔn)品做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定4種因子活性（見圖4）。凝血因子FII、FIX、FX活性均為標(biāo)準(zhǔn)品1＞標(biāo)準(zhǔn)品2＞標(biāo)準(zhǔn)品3。凝血因子FVII活性為標(biāo)準(zhǔn)品3＞標(biāo)準(zhǔn)品1＞標(biāo)準(zhǔn)品2。

圖4 鹽離子濃度對(duì)4種凝血因子活性測(cè)定的影響*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，與標(biāo)準(zhǔn)品 1相比Fig.4 The influence on the activities of four coagulation factors inthree samples by standard human plasma*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 ，compared with No.1 of standard human plasma

2.5 不同公司試劑盒對(duì)PCC4種因子活性影響 按照《中國藥典》（2010版）有關(guān)人凝血因子活性測(cè)定對(duì)PCC制品中FII、FVII、FIX、FX進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果測(cè)定如下表。通過t檢驗(yàn)分析均有P＜0.05，差異顯著。

表1 2廠家試劑盒測(cè)定4種凝血因子活性對(duì)比Tab.1 Comparison of the activities of four coagulation factors tested by regent kits of two companies

3 討論

硫酸魚精蛋白是一種堿性蛋白的硫酸鹽，在體內(nèi)可以中和肝素，致使肝素失去抗凝活性。理論上分析硫酸魚精蛋白中和肝素后，測(cè)出的凝固時(shí)間會(huì)縮短，因子活性應(yīng)該偏高，但是實(shí)驗(yàn)中測(cè)出的因子活性反而降低了。原因可能是硫酸魚精蛋白過量所致，硫酸魚精蛋白是一種弱抗凝劑，過量會(huì)使因子活性降低。因此在檢測(cè)過程中，為使因子含量能夠準(zhǔn)確測(cè)定，應(yīng)先測(cè)定PCC中肝素含量。

在實(shí)際檢測(cè)過程中，由于乏漿相對(duì)昂貴，操作者往往在測(cè)定外源因子時(shí)，并沒有嚴(yán)格按照藥典操作，而是采用純水或者配套稀釋劑稀釋。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同的稀釋處理會(huì)影響PCC中因子活性檢測(cè)的準(zhǔn)確性，且差異顯著。對(duì)于FIX的活性測(cè)定，結(jié)果說明生理鹽水與純水無顯著性差異，與配套稀釋液差異顯著。值得注意的是，2005版中國藥典[13]規(guī)定用FIX乏漿進(jìn)行稀釋處理，而2010版卻規(guī)定用生理鹽水進(jìn)行稀釋處理，這一改變的原因有待進(jìn)一步討論研究。

在PCC生產(chǎn)工藝中，洗脫條件大多采用檸檬酸鈉、NaCl溶液體系，雖然會(huì)對(duì)洗脫液進(jìn)行脫鹽處理，但是在PCC中還是會(huì)殘留一定濃度的NaCl，且濃度水平存在較大差異，因此檢測(cè)NaCl濃度對(duì)PCC中凝血因子活性的影響具有重要意義[14-16]。通過上述結(jié)果可得，較高濃度鹽溶液會(huì)使PCC中凝血四種因子活性降低，但是在檢測(cè)的過程中發(fā)現(xiàn)3種鹽濃度下的PCC制品，F(xiàn)II和FIX在0.25 mol/L鹽離子濃度下因子活性反而低于前2種情況下的活性，但是差異不顯著。

在檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)凝血因子活性檢測(cè)的影響發(fā)現(xiàn)，不同的標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)4種凝血因子的活性檢測(cè)具有顯著性影響，標(biāo)準(zhǔn)品1作為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)出的4種因子活性均值均比標(biāo)準(zhǔn)品2和標(biāo)準(zhǔn)品3高。在標(biāo)定PCC中因子含量時(shí)應(yīng)選擇同一標(biāo)準(zhǔn)品，才能準(zhǔn)確衡量凝血因子活性。采用2家公司的試劑檢測(cè)同一種PCC制品，SIEMENS公司試劑測(cè)出的因子活性除FVII外，其他因子活性均高于國內(nèi)某廠家試劑盒，且用配對(duì)t檢驗(yàn)分析差異顯著。

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Study on the in fl uening factors of four coagulation factors' altivity detemination in human prothrombin complex concentrates

TIAN Qian1，CAO Hai-jun2，CAO Ya1，HE Ze-chao1，LI Chang-qing2Δ
(1.College of Chemical Engineering，Sichuan University，Chengdu 610065， China;2.Institute of Blood Transfusion, Chinese Academy of Medical Science, Chengdu 610052，China)

ObjectiveTo study the influencing factors on detection of four coagulation factors' activity in prothrombin complex concentrates(PCC).MethodsUsing Pharmacopoeia of the People’s Republic of China (2010) as reference, the activity of four coagulation factors in PCC were investigated by choosing different pre-treatments, different diluents, different salt concentration, different standard human plasma and different company reagents.ResultsThe activity of FII, FVII, FX were decreased and FIX was increased in the condition of adding protamine sulfate, and there were no differences of four coagulation factors whether warm bath in 37 for 15 min or not. However, the differences of four coagulation factors were significant by using deficient plasma, saline, distilled water and commercial dilution buffer(P＜0.05). The activity of coagulation factor II, X in 1 mol/L salt concentration of PCC were significantly lower than in 0.25 mol/L(P＜0.05), while coagulation factor VII, IX were not. The activity of FII,FVII, FIX, and FX were different by using different standard human plasma to make standard curve. The activity of four coagulation factors existed significant difference(P=0.00) by using SIEMENS company reagents and domestic reagents.ConclusionChoosing different pre-treatments, different dilution buffers, salt concentration, standard human plasma and commercial kits will influence the detection result of coagulation factors.

prothrombin complex concentrates;protamine sulfate;dilution buffer;salt concentration;standard human plasma

R 446．11+

A

1005-1678(2014)02-0017-03

人凝血酶原復(fù)合物（prothrombin complex concentrates，PCC）是一種能促進(jìn)血液凝固的靜脈注射血漿蛋白制劑，富含依賴維生素K 合成的凝血因子（coagulation factor，F(xiàn)）II、VII、IX、X[1-2]。上世紀(jì)60年代用于臨床，主要用于乙型血友病、維生素K依賴的凝血因子缺乏癥等病癥的治療[3-4]。近年來用于口服香豆素類抗凝劑過量快速逆轉(zhuǎn)的研究成為該領(lǐng)域熱點(diǎn)[5-8]。2011以年，我國PCC短缺嚴(yán)重，目前多家廠家開展PCC的制備工藝及臨床研究，其生產(chǎn)制備引起廣泛關(guān)注[9]。因此，對(duì)于PCC中主要成分FII、FVII、FIX、FX的準(zhǔn)確測(cè)定對(duì)PCC質(zhì)量控制及臨床療效研究具有重要意義。

國內(nèi)外藥典都對(duì)PCC凝血因子活性測(cè)定進(jìn)行了規(guī)定[10]，雖然《中國藥典》（2010版）[11]也收錄了4種凝血因子活性測(cè)定方法，但是其描述的檢測(cè)步驟較為籠統(tǒng)，很多實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)究竟對(duì)測(cè)定結(jié)果有何影響，未見國內(nèi)外研究報(bào)道。此外，目前市場(chǎng)上凝血因子檢測(cè)試劑較多，在PCC制備過程中樣品含有較高的鹽離子等，這些因素對(duì)測(cè)定結(jié)果有何影響，目前也沒有較深入的研究。沈琦等[12]曾探究過PCC活性測(cè)定中的幾種影響因素，但受限于當(dāng)時(shí)的條件，僅采用血漿當(dāng)量法（即PE法）對(duì)PCC中凝血因子總活性進(jìn)行了粗探，此檢測(cè)方法已不能滿足目前對(duì)PCC質(zhì)量控制的需要。本文在《中國藥典》（2010 版）FII、FVII、FIX、FX 測(cè)定方法的基礎(chǔ)上，采用不同樣品前處理方式、不同稀釋劑、不同鹽離子濃度制品、不同測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品及不同廠家試劑，對(duì)此5種因素對(duì)PCC中4種因子活性測(cè)定的影響進(jìn)行了較深入的探討，旨在為PCC中主要作用的4種凝血因子活性測(cè)定提供參考和指導(dǎo)。

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（“863”計(jì)劃）項(xiàng)目（2012 AA 021903-3）

田倩，女，碩士，研究方向：生物工程，E-mail：tian_qian 1989@126.com；李長清，通信作者，男，碩士，教授，研究方向：血液生化與分子生物學(xué)，E-mail：lichangqing 268@163.com。