于丹，于寧，易佳麗，唐瑩，劉春英Δ

（1.遼寧中醫(yī)藥大學 基礎醫(yī)學院，遼寧 沈陽 110032；2.遼寧中醫(yī)藥大學 第一臨床學院，遼寧 沈陽 110032；3.遼寧衛(wèi)生職業(yè)技術學院 教務處，遼寧 沈陽 110101）

補中益氣湯含藥血清對A549／DDP細胞PI3K、AKT、Survivin表達的影響

于丹1，于寧2，易佳麗3，唐瑩1，劉春英1Δ

（1.遼寧中醫(yī)藥大學 基礎醫(yī)學院，遼寧 沈陽 110032；2.遼寧中醫(yī)藥大學 第一臨床學院，遼寧 沈陽 110032；3.遼寧衛(wèi)生職業(yè)技術學院 教務處，遼寧 沈陽 110101）

目的觀察補中益氣湯含藥血清對肺腺癌耐順鉑細胞株（A549／DDP）磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）、絲／蘇氨酸蛋白激酶（protein kinase B，AKT）、生存素（Survivin）蛋白表達的影響，探討其作用機制。方法制備中劑量補中益氣湯含藥血清（0.576 g／mL），將A549／DDP細胞分成4組：空白血清組、最佳含藥血清組、LY294002組、最佳含藥血清組＋LY294002組（即聯合組）。采用免疫細胞化學和免疫蛋白印跡法（western blot）方法檢測PI3K、AKT和Survivin蛋白的表達。結果最佳含藥血清組和聯合組PI3K、AKT、Survivin蛋白的表達顯著低于空白血清組（P＜0.05），聯合組PI3K、AKT、Survivin蛋白減少的更加明顯，但與最佳含藥血清組相比無統(tǒng)計學差異；LY294002組Survivin蛋白的表達明顯低于空白血清對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論補中益氣湯含藥血清作用于PI3K／AKT信號轉導通路，能降低肺腺癌順鉑耐藥細胞株PI3K、AKT、Survivin蛋白的表達，提高A549／DDP細胞對順鉑的敏感性。

肺腺癌耐順鉑細胞株；補中益氣湯含藥血清；磷脂酰肌醇3激酶；絲／蘇氨酸蛋白激酶；生存素

1 材料與方法

1.1 實驗材料 遼寧中醫(yī)藥大學動物部提供SPF級SD大鼠，體質量（200±20）g，動物許可證號：遼實動質（字）（2012-0012號）。人肺腺癌順鉑耐藥細胞株A549／DDP由中國醫(yī)科院腫瘤研究中心細胞庫提供。

1.2 實驗試劑 細胞培養(yǎng)胎牛血清（FBS）、高糖DMEM培養(yǎng)基購于Hyclone公司。美國PI3K、AKT抗體購自南京凱基生物技術有限公司。Triozol Reagent購于美國 Invitrogen Life technologies公司；青霉素由東北制藥生產（國藥準字H21022424），鏈霉素購自北京鼎國昌盛生物技術有限公司。鼠抗人Survivin單克隆抗體購于PTGLAB公司，羊抗兔熒光二抗購于凱基生物技術有限公司。

1.3 補中益氣湯含藥血清制備 根據《方劑學》規(guī)定補中益氣湯用藥劑量（黃芪18 g，白術9 g，柴胡6 g，甘草9 g，人參6 g，當歸 3 g，人參6 g，橘皮6 g，升麻6 g，柴胡6 g，白術9 g），按“動物與人體的每千克體重劑量折算系數表”計算大鼠的等效用藥劑量。實驗所用中藥全部購于遼寧中醫(yī)院。所用藥材經冷水浸泡、煮沸過濾2次，于水浴上濃縮待冷去后放入4℃冰箱保存。本次實驗采用臨床常用人劑量的中劑量按照“動物與人的每千克體重劑量折算系數表”轉換成大鼠的中劑量，即含藥0.576 g／mL。SD大鼠灌胃給藥每日一次，連續(xù)3 d，末次給藥1 h后，麻醉，腹主動脈采血，無菌管靜置30min后，離心，取上清，56℃水浴滅活，過濾除菌，分裝，－20℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 A549／DDP細胞培養(yǎng) A549／DDP細胞株在37℃，95%濕度，5%C02條件下培養(yǎng)，含10%胎牛血清高糖DMEM培養(yǎng)液中、含青霉素100U／mL，鏈霉素100 ug／mL，0.25%胰蛋白酶消化傳代，每2天換液一次，每3天傳代一次。

2 實驗方法

2.1 免疫細胞化學方法檢測PI3K、AKT、Survivin蛋白表達

將進入對數生長期A549／DDP細胞隨機分為4組：空白血清組、最佳含藥血清組、LY294002組、LY294002＋最佳含藥血清組（聯合組）。分別加入含10%SD大鼠空白血清、10%中劑量補中益氣湯含藥血清［3］、含濃度為20μM LY294002的10%SD大鼠空白血清和含1μL／100μL LY294002的10%中劑量補中益氣湯含藥血清。培養(yǎng)48 h后，4%多聚甲醛固定，3%H2O2孵育20min，10%山羊血清封閉30min，一抗孵育，4℃過夜，加二抗作用30min，DAB顯色，蘇木素復染，封片。采用Image Pro Plus醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)進行圖像分析，在400倍高倍鏡下，隨機取5個視野，每個視野為2592×1944像素點，分別測出陽性反應細胞的總面和積分光密度，求出平均光密度（average optical density，AOD）。

2.2 免疫印跡法檢測 A549／DDP細胞株中 PI3K、AKT、Survivin蛋白的表達 將A549／DDP細胞株隨機分為4組，接種于培養(yǎng)瓶中，待細胞貼壁后，具體分組及處理方法參照上述免疫細胞化學法，培養(yǎng)48 h后，提取總蛋白，4℃離心10min，取上清，BCA試劑盒測定蛋白濃度，與5×SDS上樣緩沖液煮沸5min，每孔加樣10μg，SDS-PAGE凝膠電泳，72 V恒壓轉移2 h或者35 V轉膜過夜，5%的脫脂奶粉封閉2 h。一抗4℃孵育過夜，TBST洗4次，在暗室用ECL發(fā)光，圖像掃描并分析結果。采用所測蛋白條帶與內參條帶的光密度比值來表示蛋白的表達水平。

2.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0對數據進行統(tǒng)計學分析。計量資料用“x±s”表示，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 免疫細胞化學法檢測各組A549／DDP細胞PI3K、AKT蛋白的表達 結果顯示，PI3K、AKT蛋白的表達具有較高的一致性，空白血清組及LY294002組兩種蛋白的表達水平較高，在細胞質內均可見粗大的棕黃色顆粒（見圖1、圖2）。LY294002組比較空白血清組，測得的AOD值進行數據分析，無統(tǒng)計學意義（見圖3）。最佳含藥血清組與聯合組PI3K、AKT蛋白在細胞內分布均明顯減少，僅能看見少量，染色較淺的棕黃顆粒，2組數據分別與空白血清組比較，結果進行統(tǒng)計學分析，P＜0.05，差異均具有統(tǒng)計學意義（見圖3）。且聯合組較最佳含藥血清組PI3K、AKT蛋白減少的更加明顯。

圖1 各組A549／DDP細胞PI3K蛋白表達的免疫組化結果（×200）Fig.1 Immunohistochemical results of PI3K protein expression in A549／DDP cell（×200）

圖2 各組A549／DDP細胞AKT蛋白表達的免疫組化結果（×200）Fig.2 Immunohistochemical results of AKT protein expression in A549／DDP cell（×200）

圖3 PI3K、AKT在各組 A549／DDP細胞中的AOD值*P＜0.05，與空白血清組比較Fig.3 AOD value of PI3K and p-AKT in A549／DDP cell*P＜0.05，compared with control serum group

3.2 A549／DDP細胞中 PI3K、AKT蛋白表達情況Western blot結果顯示，A549／DDP最佳含藥血清組及聯合組的PI3K、AKT蛋白表達均明顯低于空白血清對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。LY294002組細胞內 PI3K、AKT蛋白表達水平與空白血清對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義（見圖 4）。

圖4 Western blot技術檢測A549／DDP細胞PI3K、AKT蛋白的表達1.聯合組；2.LY294002組；3.最佳含藥血清組；4.空白血清組Fig.4 Expression of PI3K and AKT by western blotmethod

3.3 免疫細胞化學法檢測A549／DDP細胞中Survivin表達 Survivin蛋白在細胞膜和細胞漿中均有表達。A549／DDP空白血清組中Survivin表達呈強陽性，可見大量粗大的棕黃色顆粒，顏色較深。最佳含藥血清組、LY294002組和聯合組，Survivin蛋白表達的較少，棕黃色的顆粒密度較低，顏色較淺，明顯低于空白血清對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見圖5）。聯合組Survivin蛋白表達減少的更加明顯。各組Survivin蛋白表達的光密度值見圖6。

圖5 各組A549／DDP細胞Survivin蛋白表達的免疫組化結果（×200）Fig.5 Expression of Survivin in A549／DDP（×200）

圖6 PI3K、AKT在各組A549／DDP細胞中的AOD值*P＜0.05，與空白血清組比較Fig.6 AOD for Survivin expression in A549／DDP cell*P＜0.05，compared with control serum group

3.4 Western blot技術檢測各組A549／DDP細胞Survivin蛋白的表達 Western blot結果顯示，A549／DDP最佳含藥血清組、LY294002組及聯合組的Survivin蛋白表達均明顯低于空白血清對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見圖7）。

圖7 Western blot檢測A549／DDP細胞Survivin蛋白的表達1.空白血清組；2.最佳含藥血清組；3.LY294002組；4.聯合組Fig.7 Expression of Survivin by western blotmethod 1.control serum group；2.the bestmedicated serum group；3.LY294002（blockers）group；4.LY294002＋bestmedicated serum group

4 討論

肺癌是嚴重威脅人類生命的惡性腫瘤，全球每年死于肺癌人數超過100萬，約85%為非小細胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer，NSCLC）［7］。化療是臨床常用的治療手段，而惡性腫瘤對化療藥物的耐藥性是腫瘤化療的主要障礙［8］。如何解決腫瘤對化療藥物的耐藥性成為腫瘤治療中丞待解決的關鍵問題。補中益氣湯有補中益氣，升陽舉陷之功效。方中黃芪，補益中士，溫養(yǎng)脾胃；方中人參、白術、甘草，甘溫益氣，補益脾胃［9］。臨床將補中益氣湯應用于肺癌的治療，能夠提高患者免疫力，補氣健脾，減輕化療副反應，有效改善肺癌耐藥，提高臨床治療效果［10-11］。

PI3K／Akt信號通路與肺腺癌的細胞增殖、存活、耐藥密切相關。PI3K由異源二聚體復合物組成，包括有一個催化亞單位（p110）和調節(jié)亞單位（p85）［12］。Akt基因又被稱為蛋白激酶 B，是PI3K下游的作用靶點。Akt是化療耐藥的中樞介質，研究表明抑制Akt，阻止Akt的磷酸化，可以中斷PI3K／Akt信號通路的轉導，降低化療的耐藥性［13-14］，Brognard等［15］報道 PI3K活化的非小細胞肺癌對化療產生耐藥性，應用PI3K的抑制劑可使肺癌細胞對放化療的敏感性增加。

本研究根據中藥血清藥理學理論制備補中益氣湯含藥血清，根據前期的研究結果，采用已篩選出來的最佳換藥血清濃度，即10%中劑量的含藥血清作用于A549／DDP細胞48 h。免疫細胞化學法和Western blot法結果一致，最佳含藥血清組和聯合組PI3K、Akt的表達均明顯減少，與空白血清對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。表明補中益氣湯含藥血清能夠有效降低PI3K、Akt蛋白的表達，影響PI3K／Akt信號轉導通路。其中聯合組較最佳含藥血清組PI3K、Akt蛋白減少的更加明顯，分析補中益氣湯含藥血清與LY294002可能存在著協同作用。LY294002是PI3K／Akt信號通路的抑制劑，具有靶向抑制PI3K催化亞基p110的作用，PI3K阻斷劑作用于亞基p110，抑制Akt磷酸化，使磷酸化的 Akt（p-Akt）減少［4］，阻斷 PI3K／Akt通路在肺癌順鉑耐藥中的作用，但對PI3K、Akt這2種蛋白的總體表達影響不大，實驗結果也表明LY294002組PI3K、Akt蛋白表達與空白血清對照組相比，2種蛋白的表達并沒有明顯的變化。

Survivin是凋亡抑制蛋白IPA家族成員，又名存活素，是凋亡抑制最強的因子。直接抑制半胱氨酸天冬氨酸酶-3、半胱氨酸天冬氨酸酶-7（Caspase-3、Caspase-7）的活性［16］，阻斷細胞凋亡。Survivin蛋白在正常分化組織中幾乎不表達，但在大多數腫瘤組織中表達。有報道，部分腫瘤Survivin的表達與AKT的活性是密切相關的［17］。本實驗研究對A549／DDP細胞Survivin蛋白進行定位和定量分析，免疫細胞化學方法和Western blot法結果顯示，最佳含藥血清組、LY294002組、聯合組Survivin蛋白的表達下降，與空白血清對照組對比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。表明補中益氣湯能夠有效的降低A549／DDP細胞內Survivin的表達。Survivin作為PI3K／Akt細胞信號通路的下游因子，其表達的下調與PI3K、Akt蛋白表達的減少存在一定的相關性，推測補中益氣湯含藥血清通過降低PI3K、Akt蛋白的表達進一步調節(jié)Survivin活性，以實現逆轉肺腺癌順鉑耐藥。

綜合本實驗結果，補中益氣湯含藥血清以PI3K／Akt信號通路為靶點，下調PI3K、Akt蛋白的表達，進而抑制凋亡抑制蛋白Survivin的表達以提高A549／DDP細胞對順鉑的敏感性。補中益氣湯含藥血清降低肺癌順鉑耐藥為多靶向，多作用位點，具體機制仍有待于更進一步的研究。

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（編校：吳茜）

Effect of Buzhong Yiqi Decoction medicated serum to the expression of PI3K、AKT、Survivin in lung adenocarcinoma cell lines A549／DDP

YU Dan1，YU Ning2，YIJia-li3，TANG Ying1，LIU Chun-ying1Δ

（1.Preclinical Medicine Academy，Liaoning university of traditional Chinesemedicine College，Shenyang 110032，China；
2.The First Clinical Academy，Liaoning university of traditional Chinesemedicine，Shenyang 110032，China；
3.Dean’s Office，Liaoning College of Health Vocational Technology，Shenyang 110101，China）

ObjectiveTo observe the effectof Buzhong Yiqi Decoctionmedicated serum on PI3K、AKT、survivin in lung adenocarcinoma A549／DDP cells，and explore its functionalmechanism.MethodsBuzhong Yiqi Decoction medicated serum ofmiddle dosage（0.576 g／mL）were prepared，and A549／DDP cellswere divided into four groups：blank serum group，the best containingmedicine serum group and LY294002 group（blockers group），the best containing medicine serum＋LY294002 group（combination group）.The protein expression of PI3K，AKT and Survivin were detected by Immunocytochemistry and Western blot.ResultsComparewith blank serum group，the protein expression of PI3K、AKT and Survivin in best containing medicine serum and combination group were significantly lower（P＜0.05），and the later was more lower，but there was no significant differences between best containingmedicine serum and combination group.The expression of survivin in LY294002 group were significantly lower than blank serum group（P＜0.05）.ConclusionBuzhong Yiqi Decoction can reduce the protein expression of PI3K，AKT and surviving，increase the sensitivity of A549／DDP to DDP through PI3K／AKT signal transduction pathway.

A549／DDP；Buzhong Yiqi Decoctionmedicated serum；PI3K；AKT；Survivin

R734.2

A

1005－1678（2014）03－0004－04

肺癌的發(fā)病率在世界范圍呈明顯增高趨勢，世界衛(wèi)生組織報告肺癌將是21世紀危害人類健康最嚴重的疾病之一［1］?；瘜W藥物治療是綜合治療肺癌的重要手段，但是肺癌細胞對不同化療藥物的耐受，使得非小細胞肺癌的5年生存率不超過20%［2］。中醫(yī)學認為正氣虛損是肺癌順鉑耐藥的主要原因，已有研究表明［3-4］，培土生金法可有效干預肺癌順鉑耐藥。補中益氣湯為培土生金中藥代表方劑，臨床應用補中益氣湯以減輕化療引起的不良反應，改善肺癌耐藥，但機制尚不清楚。磷脂酰肌醇3激酶／蛋白激酶B信號轉導通路在細胞增殖、分化、腫瘤的血管形成和轉移等方面起著重要的作用［5］。近幾年，已經有大量文獻報道PI3K／Akt信號傳導通路的異常與腫瘤生長、維持和化療耐藥等方面有關［6］。本研究通過血清藥理學方法，觀察補中益氣湯藥對A549／DDP細胞PI3K、Akt及Survivin蛋白表達的影響，以期從分子生物學水平探討補中益氣湯逆轉肺癌順鉑耐藥的具體機制。

國家自然科學基金資助項目（81072743）

于丹，女，博士生，講師，研究方向：中藥干預腫瘤細胞凋亡，E-mail：yudanzzm＠163.com；劉春英，通信作者，女，教授，博士生導師，研究方向：中藥抗腫瘤作用機制研究，E-mail：chunying99＠163.com。