王迎春，哈敏文，王彥，劉維，李滿

（遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 綜合一病區(qū)，遼寧 錦州 121001）

5-氮雜-2’-脫氧胞苷對(duì)胰腺癌細(xì)胞株Capan-2增殖及其PCDH8基因表達(dá)的影響

王迎春，哈敏文Δ，王彥，劉維，李滿

（遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 綜合一病區(qū)，遼寧 錦州 121001）

目的探討5-氮雜-2’-脫氧胞苷（5-Aza-2’-deoxycytidine，5-Aza-CdR）對(duì)胰腺癌細(xì)胞株增殖的影響以及對(duì)其原鈣黏附素（protocadherin 8，PCDH8）基因表達(dá)的影響。方法用不同濃度的5-Aza-CdR處理胰腺癌Capan-2細(xì)胞。陰性對(duì)照組不加藥，根據(jù)5-Aza-CdR處理的劑量分為：0.08μmol／L組、0.40μmol／L組、2.00μmol／L組、10μmol／L組、50μmol／L組，檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況；采用RT-PCR和Western Blot檢測(cè)各組胰腺癌細(xì)胞PCDH8基因和蛋白的表達(dá)。結(jié)果5-Aza-CdR對(duì)胰腺癌細(xì)胞具有明顯的抑制作用，且隨著濃度的增加，抑制率逐漸增強(qiáng)（P＜0.01）；但是隨著時(shí)間的增加，抑制率逐漸下降（P＜0.01）。5-Aza-CdR和吉西他濱聯(lián)用對(duì)胰腺癌細(xì)胞的抑制作用和誘導(dǎo)凋亡作用最強(qiáng)（P＜0.05，P＜0.01）。5-Aza-CdR能顯著增加胰腺癌細(xì)胞PCDH8基因和PCDH8蛋白的表達(dá)水平，且隨著濃度的升高，增加作用越明顯（P＜0.01）。結(jié)論5-Aza-CdR能夠抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖，增加PCDH8基因的表達(dá)，與吉西他濱聯(lián)合后抑制作用更強(qiáng)。

5-氮雜-2’-脫氧胞苷；胰腺癌；PCDH8基因

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 試驗(yàn)細(xì)胞為人胰腺癌細(xì)胞株Capan-2細(xì)胞系（上海艾研生物科技有限公司提供）。RPMI 1640培養(yǎng)基（上海博升生物科技有限公司）。主要試劑有5-Aza-CdR（TaKaRa公司）；MTT、胰蛋白酶（Sigma公司）；RNA提取試劑盒、蛋白提取試劑盒（英諾生物）；鼠抗人PCDH8單克隆抗體、羊抗鼠IgG抗體（艾美捷科技有限公司）。easyCyte 8流式細(xì)胞儀（Guava，美國(guó)），Auto2000細(xì)胞計(jì)數(shù)器（Nexcelom公司，美國(guó)），ScanDrop 100蛋白定量?jī)x（耶拿分析儀器股份公司，德國(guó)）。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人胰腺癌細(xì)胞Capan-2細(xì)胞37℃水浴復(fù)蘇，1000 r／min離心10 min，留沉淀。細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)、消化、傳代，細(xì)胞生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，將細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度為2×103個(gè)／孔，接種于96孔板，每5個(gè)復(fù)孔為1組，在37℃，5%CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 藥物處理 顯微鏡下可見細(xì)胞單層貼壁后進(jìn)行分組加藥處理。陰性對(duì)照組不加藥，根據(jù)5-Aza-CdR處理的劑量分為：0.08μmol／L組、0.40μmol／L組、2.00μmol／L組、10μmol／L組、50μmol／L組。5-Aza-CdR與吉西他濱聯(lián)合作用評(píng)價(jià)：Ⅰ組加入吉西他濱 20μmol／L，Ⅱ組加入 5-Aza-CdR 0.12μmol／L，Ⅲ組加入吉西他濱和5-Aza-CdR，對(duì)照組不加藥物。

1.3 觀察指標(biāo) 每組藥物處理24 h、48 h、72 h后，采用MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率，在OD值490 nm處測(cè)定吸光值。抑制率＝（陰性對(duì)照組OD值-加藥組OD值）／陰性對(duì)照組OD值×100%。細(xì)胞凋亡檢測(cè)采用Annexin V-FTIC／PI雙染法，凋亡率＝凋亡細(xì)胞數(shù)／總細(xì)胞數(shù)。胰腺癌細(xì)胞PCDH8基因表達(dá)檢測(cè)：分別以不同濃度（0、0.4、2.0、10.0μmol／l）5-Aza-CdR處理胰腺癌細(xì)胞，培養(yǎng)4 d后提取細(xì)胞基因組總RNA，測(cè)定RNA濃度和純度，對(duì)完整性進(jìn)行鑒定。之后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，RT-PCR檢測(cè)PCDH8基因的表達(dá)。細(xì)胞PCDH8蛋白表達(dá)檢測(cè)：將1×106個(gè)細(xì)胞／瓶接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，分別加 0、0.4、2.0、10.0μmol／L 5-Aza-CdR處理4 d，之后提取細(xì)胞蛋白，Western Blot檢測(cè)細(xì)胞PCDH8蛋白表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS15.0分析數(shù)據(jù)，正態(tài)計(jì)量資料采用“±s”表示，采用F檢驗(yàn)或t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 5-Aza-CdR對(duì)胰腺癌細(xì)胞的抑制作用 5-Aza-CdR對(duì)胰腺癌細(xì)胞具有明顯的抑制作用，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，抑制率逐漸增強(qiáng)，當(dāng)濃度達(dá)到50.00μmol／L時(shí)，抑制率出現(xiàn)下降情況（P＜0.01）。隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)，抑制率逐漸下降（P＜0.01，見表1）。

表1 5-Aza-CdR對(duì)胰腺癌細(xì)胞的抑制作用（%）Tab.1 Inhibition effect of5-Aza-CdR on pancreatic cancer cell（%）

2.2 5-Aza-CdR聯(lián)合吉西他濱對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響 藥物處理后，各加藥組OD值均明顯下降，其中以聯(lián)合組下降幅度最大，說明聯(lián)合組對(duì)胰腺癌細(xì)胞增值的抑制作用最強(qiáng)，與單獨(dú)5-Aza-CdR組和吉西他濱組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；細(xì)胞凋亡率也屬聯(lián)合組的最高，與其他2組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。5-Aza-CdR組和吉西他濱組在抑制率和凋亡率上無明顯差異（見表2）。

表2 5-Aza-CdR聯(lián)合吉西他濱對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響Tab.2 Results of 5-Aza-CdR and gemcitabine on pancreatic cancer cell proliferation and apoptosis

2.3 不同濃度5-Aza-CdR對(duì)胰腺癌細(xì)胞PCDH8基因和PCDH8蛋白表達(dá)的影響 正常胰腺癌細(xì)胞不表達(dá)PCDH8基因和其蛋白，經(jīng)5-Aza-CdR誘導(dǎo)后表達(dá)，且隨著5-Aza-CdR濃度增加，表達(dá)逐漸增多（見表3，圖1）。

圖1 PCDH8基因（a）和蛋白（b）表達(dá)Fig.1 PCDH8 gene and protein expressionM：DS2000 DNA marker；1.對(duì)照組；2.0.4μmol／L 5-Aza-CdR組；3.2.0μmol／L 5-Aza-CdR組；4.10.0μmol／L 5-Aza-CdR組；5.β-actin

3 討論

5-Aza-CdR是去DNA甲基化抑制劑，通過與DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶結(jié)合，逆轉(zhuǎn)基因甲基化過程，恢復(fù)基因表達(dá)和功能［6］。白和平等［7］研究顯示5-氮雜-2’-脫氧胞苷酸可抑制人乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，其抑制率與藥物濃度、作用時(shí)間呈依賴關(guān)系，與5-Aza—CdR去甲基化，促進(jìn)RUNX3基因及蛋白表達(dá)有關(guān)。黃鈾新等［8］研究顯示5-氮雜-2’-脫氧胞苷能有效抑制DLK1基因的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞HepG2生長(zhǎng)、增殖、侵襲能力。張洪典等［9］研究顯示5-Aza-CdR能夠逆轉(zhuǎn)BNIP3基因在ESCCKyse-140細(xì)胞株中的高甲基化狀態(tài)，解除DNA高甲基化導(dǎo)致的基因沉默，從而恢復(fù)其mRNA和蛋白水平的表達(dá)，同時(shí)顯著抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖能力（P＜0.01）。吉西他濱是一種破壞細(xì)胞復(fù)制的二氟核苷類抗代謝物抗癌藥，是去氧胞苷的水溶性類似物，是核糖核苷酸還原酶的一種抑制性酶的替代物，這種酶在DNA合成和修復(fù)過程中，對(duì)脫氧核苷酸的生成至關(guān)重要［10-11］。既往吉西他濱是治療晚期胰腺癌的主要藥物，但是患者的的1年生存率仍然很低，而中位生存期只有5.4～5.6個(gè)月。聯(lián)合5-Aza-CdR和吉西他濱作用于胰腺癌細(xì)胞，結(jié)果顯示，其對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用和誘導(dǎo)凋亡的作用強(qiáng)于單用2種藥物，說明2者具有協(xié)同作用。

PCDH8屬于鈣黏附素家族的一個(gè)亞族，其整體結(jié)構(gòu)與其他原鈣黏附素很相似，與其他鈣黏附素家族成員具有高度的同源性［12］。原鈣黏附素具有介導(dǎo)細(xì)胞間的黏附作用的能力，但其黏附性較經(jīng)典鈣黏附素弱。目前PCDH8基因被認(rèn)為是一種潛在的抑癌基因。石宇良［13］等研究顯示PCDH8基因的表達(dá)能降低鼻咽癌細(xì)胞的增殖、侵襲能力，延緩細(xì)胞分裂周期。PCDH8的表達(dá)缺失、甲基化、雜合性缺失可能與腫瘤細(xì)胞的快速增殖相關(guān)［14］。PCDH8在胰腺癌細(xì)胞中不表達(dá)，可能是因?yàn)镻CDH8在胰腺癌細(xì)胞中發(fā)生異常高甲基化。經(jīng)過5-Aza-CdR處理后，胰腺癌Capan-2細(xì)胞中PCDH8發(fā)生去甲基化，從而恢復(fù)基因表達(dá)，發(fā)揮抑制胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。本研究結(jié)果顯示：5-Aza-CdR能夠顯著增加PCDH8基因和PCDH8蛋白的表達(dá)，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，抑制率逐漸增強(qiáng)（P＜0.01），當(dāng)濃度為50.00μmol／L時(shí)，抑制率出現(xiàn)下降情況，尤其在作用48 h以及72 h時(shí)，下降明顯，具體原因還不十分明確。

綜上所述，5-Aza-CdR能夠抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，且與吉西他濱具有協(xié)同作用，其可能機(jī)制為5-Aza-CdR通過抑制PCDH8基因甲基化增加PCDH8基因和PCDH8蛋白表達(dá)。

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（編校：吳茜）

Effect of 5-Aza-CdR on pancreatic carcinoma Capan-2 cell proliferation and PCDH8 gene expression

WANG Yin-chun，HA Min-wenΔ，WANG Yan，LIUWei，LIMan

（Comprehensive Ward One，The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical College，Jinzhou 121001，China）

ObjectiveTo discuss the effect of 5-Aza-CdR on pancreatic carcinoma Capan-2 cell proliferation and PCDH8 gene expression.MethodsPancreatic carcinoma Capan-2 cellswere treated with different doses of5-Aza-CdR with orwithout gemcitabine，negative control group without drug，0.08μmol／L group with 0.08μmol／L 5-Aza-CdR，0.40μmol／L group with 0.40μmol／L 5-Aza-CdR，2.00μmol／L group with 2.00μmol／L 5-Aza-CdR，10μmol／L group with 10μmol／L 5-Aza-CdR，50μmol／L group with 50μmol／L 5-Aza-CdR.The inhibition ratio of Capan-2 cell proliferation were observed by MTT assay and PCDH8 gene and protein expression were detected by RT-PCR and Western blot.ResultsThe inhibition ratio was increased with 5-Aza-CdR dose increasing（P＜0.01），but decreased apparently with times extending（P＜0.01）.Inhibition ratio in 5-Aza-CdR and gemcitabine group was higher than thosewith only 5-Aza-CdR or gemcitabine groups（P＜0.05 or P＜0.01）.The levels of PCDH8 gene and protein expression were increased significantly in 5-Aza-CdR treatment groups，with dose dependent（P＜0.01）.Conclusion5-Aza-CdR can inhibit the proliferation of pancreatic carcinoma Capan-2 cell proliferation，and increase PCDH8 gene expression.The inhibition effect is strongwhen combined with gemcitabine.

5-Aza-CdR；pancreatic carcinoma；PCDH8 gene

R735.2

A

1005－1678（2014）03－0016－03

胰腺癌是常見的胰腺腫瘤，是一種惡性程度很高，診斷和治療都很困難的消化道惡性腫瘤，約90%為起源于腺管上皮的導(dǎo)管腺癌。其發(fā)病率和死亡率近年來明顯上升。5年生存率＜1%，是預(yù)后最差的惡性腫瘤之一。胰腺癌早期的確診率不高，發(fā)現(xiàn)時(shí)往往已經(jīng)失去了手術(shù)治療的最佳時(shí)機(jī)，加上其具有高度的侵襲性，因此患者預(yù)后較差，死亡率較高，總體生存率較低。原鈣黏附素（protocadherins，PCDHs）屬于鈣黏附素家族，研究顯示其在一些腫瘤中具有抑制腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移的作用［1-3］。5-氮雜-2’-脫氧胞苷（5-Aza-2’-deoxycytidine，5-Aza-CdR）是一種胞嘧啶類似物，是甲基化抑制劑，具有較強(qiáng)的去甲基化作用［4-5］。本研究采用5-Aza-CdR處理胰腺癌細(xì)胞，旨在探討其對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖及PCDH8表達(dá)的影響。

遼寧省科技廳課題（2012225019）

王迎春，女，本科，中級(jí)職稱，研究方向：腫瘤的臨床治療，E-mail：huangdan0130＠126.com；哈敏文，通信作者，男，博士，教授、主任醫(yī)師、碩士生導(dǎo)師，研究方向：腫瘤的臨床治療，E-mail：huangdan0130＠126.com。