黃 丹，高貝貝，李 莉，蘇晶瑩，高 源，閆金松，劉曉暉，邵 靜，康志杰

(1.大連醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院血液科，遼寧大連 116027;2.大連醫(yī)科大學 公共衛(wèi)生學院，遼寧 大連 116044)

慢性粒細胞白血病BCR-ABL融合基因實時定量檢測平臺的建立

黃 丹1，高貝貝1，李 莉1，蘇晶瑩1，高 源1，閆金松1，劉曉暉2，邵 靜2，康志杰1

(1.大連醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院血液科，遼寧大連 116027;2.大連醫(yī)科大學 公共衛(wèi)生學院，遼寧 大連 116044)

目的 建立慢性粒細胞白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)患者BCR-ABL融合基因檢測及微小殘留病變實時定量監(jiān)測的診斷平臺。方法 依據(jù)GenBank中編碼P210蛋白的融合基因M(b2a2，b3a3)及ABL的基因序列，分別設計引物及Taqman探針，以BCR-ABL陽性的CML患者cDNA為模板，通過PCR擴增出587 bp的基因片段，連入pMD 18-T載體，制備成標準品并繪制標準曲線，運用實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，RQ-PCR)技術監(jiān)測BCR-ABL轉錄水平的變化。結果 成功構建BCR-ABL標準品。應用RQ-PCR探針法，以ABL為內(nèi)參，對CML患者進行BCR-ABL融合基因的檢測，得到比較穩(wěn)定的定量數(shù)據(jù)，與定性結果一致。結論 自行構建BCR-ABL質粒為標準品，運用RQ-PCR實時監(jiān)測BCR-ABL融合基因的表達變化，敏感性好，穩(wěn)定性高，對臨床檢驗具有普遍意義。

慢性粒細胞白血病;BCR-ABL;標準品;實時熒光定量PCR;診斷平臺

慢性粒細胞白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)是起源于骨髓多能造血干細胞的惡性增殖性疾病，其細胞遺傳學特征是具有Ph染色體 t(9;22)(q34;q11)［1-2］，形成 BCR - ABL 融合基因，該融合基因編碼的BCR-ABL融合蛋白具有很強的酪氨酸激酶活性，可抑制髓系細胞的粘附和凋亡，促使細胞不依賴于細胞生長因子而過度增殖，引發(fā)大量異常細胞的惡性增殖［3］。近年來，隨著分子生物學技術的發(fā)展和對發(fā)病機制的研究，腫瘤靶向治療已經(jīng)成為CML治療的一線方案［3］，而針對BCRABL融合基因的檢測及監(jiān)測為CML的診治提供了可靠的分子依據(jù)［4-5］。因此，建立穩(wěn)定、有效、可行的實時定量檢測BCR-ABL融合基因的方法是非常必要的［6］。

1 材料和方法

1.1 材 料

試劑及儀器:RNAiso Plus(D9108A)，pMD 18-T Vector(D109A)，限制性內(nèi)切酶EcoRI(D1040A)，HindIII(D1060A)，質粒純化試劑盒(DV805A)，PCR引物的合成及高保真PCR試劑盒(DR001A)均購自大連寶生物公司;反轉錄試劑盒及RQ-PCR試劑盒 RocketScript RT PreMix(AccuPower?)和 Accu-Power?DualstarTM qPCR PreMix，均購自 Bioneer公司。PCR儀為Applied Biosystems?GeneAmp?PCR System 9700和 Applied Biosystems?GeneAmp?PCR System 7500等。

1.2 方 法

1.2.1 引物設計:參照歐洲抗癌工作組多中心實驗方法［7］，以國際廣泛應用并認可的ABL基因為內(nèi)參，根據(jù) GenBank人 BCR-ABL(e14a2)cDNA AJ131466、人v-Abl cDNA NM_007313分別設計上下游引物，構建BCR-ABL基因檢測標準品，引物及探針為韓國Bioneer公司合成。分別設計檢測BCR-ABL融合基因及內(nèi)參基因的特異性引物及探針，引物設計示意圖及具體序列見圖1和表1。

圖1 BCR-ABL引物設計示意圖Fig 1 Design of primers and probes of BCR-ABL

表1 BCR-ABL引物序列Tab 1 Sequences of primers and probes of BCR-ABL

1.2.2 BCR -ABL(S)標準品質粒的構建:提取患者外周血單個核細胞RNA，反轉錄為cDNA，應用巢式PCR篩查陽性標本［8］，將回收的BCR-ABL片斷，插入 pMD 18-T載體中，構建 pMD 18TBCR-ABL(S)質粒作為標準品。通過酶切鑒定后送測序，結果回報正確。擴增體系與條件:10×buffer 5 μL，dNTPs 5 μL，引物各2.0 μL，模板 cDNA 2.0 μL，Taq 酶 0.5 μL，H2O 33.25 μL。94 ℃ 變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，32 個循環(huán)。

1.2.3 標準曲線的制作:將構建成功的質粒轉化擴增，根據(jù)Avogadro常數(shù)和核酸的平均分子量進行計算拷貝數(shù)，具體為:拷貝數(shù)/μL=(ng/μL ×10-9×6.02×1023)/(DNA堿基數(shù)×660)。將質粒稀釋為 107/μL、106/μL、105/μL、104/μL、103/μL、102/μL和10/μL，制成標準品，通過實時定量繪制標準曲線。

1.2.4 CML患者標本的實時定量PCR檢測與分析:提取CML患者外周血單核細胞總RNA，反轉錄為cDNA作為模板，以ABL為內(nèi)參，進行實時熒光定量檢測，將檢測結果與標準曲線對比，得出拷貝數(shù)。為了檢測的穩(wěn)定性和準確性，每批實驗需設置陰性對照及空白對照，同時設置3復孔，實驗體系為20 μL，cDNA 2 μL、Pre Mix10 μL、RoxⅡ0.4 μL、上游引物 1 μL(10 pmol/μL)、下游引物 1 μL、探針 1 μL、水 4.6 μL，反應條件為解鏈 95 ℃ 5 s，退火 60℃ 30 s，60℃時采集熒光，共40個循環(huán)。

2 結果

2.1 pMD 18T-BCR-ABL(S)質粒的構建

以BCR-ABL(e14a2)陽性患者cDNA為模板，以BCR-ABL S-F+R為引物，成功擴增到597 bp目的片段(圖2)。將擴增到的片段進行膠回收純化，與 pMD 18-T Vector連接構建標準品 pMD 18T-BCR-ABL(S)，以EcoR I及Hind Ш雙酶切，1.5%瓊脂糖凝膠電泳顯示378 bp條帶，證明擴增引物成功連入pMD 18-T Vector(圖3)。將連接產(chǎn)物膠回收純化送測序，回報序列完全正確，標準品構建成功(圖4和5)。

圖2 PCR產(chǎn)物電泳圖Fig 2 Electrophoretogram of PCR products

圖3 酶切圖譜Fig 3 Restriction map of standard

圖4 pMD 18T-BCR-ABL(S)示意圖Fig 4 Diagram of pMD 18T-BCR-ABL(S)

圖5 pMD 18T-BCR-ABL(S)測序結果Fig 5 Sequencing result of pMD 18T-BCR-ABL(S)

2.2 標準品的制備及驗證

2.2.1 核酸的定量及拷貝數(shù)的計算:pMD 18TBCR-ABL(S)質粒DNA定量結果為3040 ng/μL。故根據(jù)計算公式得到拷貝數(shù)為8.56×1011(copies/μL)。

2.2.2 標準品的制備:將質粒做10倍梯度稀釋，數(shù)量分別為 8.56 × 107、8.56 × 106、8.56 × 105、8.56 ×104、8.56 × 103、8.56 × 102、8.56 × 101(copies/μL)，以各拷貝梯度樣品為模板，進行RQ-PCR擴增，同時設置3復孔及空白對照，圖6為不同濃度質粒的擴增曲線，結果顯示，不同濃度的模板在PCR擴增后按濃度由高到低的順序均勻排列，即擴增曲線可以反映起始模板的量，將擴增產(chǎn)物進行1.1%的瓊脂糖凝膠電泳，可見明確的目的條帶，并隨濃度的增加擴增產(chǎn)量增大，證明擴增曲線為特異性擴增。圖7為應用質粒標準品繪制標準曲線。結果表明，質粒拷貝數(shù)與熒光信號進入設定的閾值時經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(thresholdcycle，Ct)呈現(xiàn)良好的線性關系，可以用于模板拷貝數(shù)的定量。

圖6 標準品的擴增曲線Fig 6 Amplification plot of the standards

圖7 pMD 18T-BCR-ABL(S)為模板建立的標準曲線Fig 7 Standard curve exhibited a good linear relationship between absorbance and pMD 18T-BCR-ABL(S)concentration

2.3 CML患者標本的實時定量PCR分析

以患者cDNA為模板，以構建的 pMD 18TBCR-ABL(S)為標準品，以ABL為內(nèi)參，應用Taqman探針法，進行患者BCR-ABL融合基因的檢測，可以得到比較穩(wěn)定的定量數(shù)據(jù)，與定性結果一致(圖8和圖9)。

3 討論

圖8 利用RQ-PCR實驗體系對慢性粒細胞患者血液標本進行BCR-ABL拷貝數(shù)檢測Fig 8 Monitoring of BCR-ABL copies in CML patients by RQPCR

圖9 RT-PCR檢測患者血液標本DNA擴增產(chǎn)物1.1%的瓊脂糖凝膠電泳Fig 9 The samples were amplified with RT-PCR and the products were showed in 1.1%Agar

基因變異是腫瘤形成的根本原因，其中一些特定的突變類型會導致特定的腫瘤，如Ph染色體的形成可直接造成慢性粒細胞白血病的發(fā)生。自Ph染色體被發(fā)現(xiàn)以來，臨床廣泛應用細胞遺傳學方法檢測Ph染色體做CML的診斷和療效監(jiān)測。然而基因異?？煞譃槎喾N形式，染色體核型分析在甄別細微染色體異常時，并不能達到預期的效果。近十余年來，分子生物學方法檢測BCR-ABL融合基因的應用逐漸普及。BCR-ABL融合基因的水平與臨床療效有很好的相關性［7］，能預先對臨床病情變化提出警示，對于白血病微小殘留病的監(jiān)測和及時調(diào)整治療方案都有重要意義，尤其是分子靶向藥物的應用，使得分子檢測成為CML治療中不可缺少的一部分，因此，定期檢測BCR-ABL融合基因對臨床診療的意義已經(jīng)于世界范圍內(nèi)達成共識［9］。

實時定量PCR(RQ-PCR)方法檢測靈敏度高，特異性好，能檢測到 10-6～10-5個腫瘤細胞，是目前國際上應用檢測微小殘留病變最普遍的方法，使用實時定量PCR技術監(jiān)測BCR-ABL分子學水平是評價療效以及獲得完全細胞遺傳學反應的最佳方法，但因為已有商品化試劑費用昂貴，故未能廣泛應用于臨床檢驗。而以分子生物學技術為基礎，自行構建含有BCR-ABL基因的環(huán)形質粒為標準品，以國際廣泛應用并認可的ABL基因為內(nèi)參基因，與熒光定量方法相結合，兼顧靈敏性與特異性，經(jīng)濟、快速、穩(wěn)定，對臨床診斷具有潛在價值，值得推廣。

目前發(fā)現(xiàn)的BCR-ABL融合基因一共有3個亞型［4］，ABL的斷裂點始終發(fā)生在第2號外顯子，而BCR的斷裂點分別發(fā)生在第13、14號外顯子，1號外顯子及19號外顯子，從而形成了不同的亞型，即M(b2-a2，b3-a2)，m(e1-a2)及 u(e19-a2)，M型編碼210 kd的蛋白，主要見于90%以上的CML患者，而m型編碼190 kd的蛋白，u型編碼230 kd的蛋白，在CML患者中發(fā)生率較低。本實驗室針對發(fā)生于大多數(shù)CML患者的M型BCR-ABL融合基因設計引物，成功建立起穩(wěn)定可行的實時定量PCR檢測平臺，為CML患者的診治工作提供了有效的分子支持。

基因檢測對臨床的診斷及治療發(fā)揮著越來越重要的作用，應用分子生物學方法可以快速建立其他融合基因的特異性檢測方法。因此，依托分子生物學實驗室，參照歐洲抗癌工作組多中心實驗方法，經(jīng)患者本人同意及倫理委員會審批，利用其BCRABL陽性標本，構建質粒做為標準品，以國際廣泛應用并認可的ABL基因為內(nèi)參基因，以Taqman探針法，設計目的基因引物及探針，應用RQ-PCR技術，監(jiān)測BCR-ABL融合基因的表達情況，敏感性好，穩(wěn)定性高，可操作性強，對臨床檢驗具有普遍意義，值得推廣。

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Development of a diagnosis platform for real time quantitation of BCR-ABL fusion gene in chronic myelogenous leukemia

HUANG Dan1，GAO Bei-bei1，LI Li1，SU Jing -ying1，GAO Yuan1，YAN Jin -song1，LIU Xiao-hui2，SHAO Jing2，KANG Zhi-jie1
(1.Department of Hematology，the Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian116027，China;2.Department of Public Health，Dalian Medical University，Dalian116044，China)

［Abstract］ObjectiveTo improve clinical diagnosis and treatment of chronic myeloid leukemia(CML)，we aim to establish a diagnosis platform for detecting BCR-ABL fusion gene and mornitoring minimal residual disease by constructing a circular plasmid using BCR-ABL fusion gene as a standard.MethodsWe designed primers and Taqman probes specific to BCRABL(b2-a2，b3-a2)and ABL，and used cDNA of the CML patient as the tamplate to amplify a BCR -ABL fragment.The 587bp PCR product of BCR -ABL was cloned into pMD 18T vector and used as a reference standard.The copy numbers was then determined and standard curve derived.The transcriptional expression of BCR/ABL in bone marrow samples from patients was quantitated by real-time quantitative PCR(RQ-PCR).ResultsWe constructed a circular plasmid with BCRABL fusion gene according to the method from cancer groups in Europe.With pMD 18T BCR -ABL plasmid as reference standard and ABL as an internal control，we accurately detected BCR -ABL expression in CML patients using Taqman based RQ-PCR.After further verification on technical feasibility and data reliability，a diagnosis platform for detecting BCR -ABL fusion gene and minimal residual disease in CML patients was then established.ConclusionThe Taqman based RQ -PCR can greatly improve the sensitivity and reliability in detection of BCR -ABL fusion gene expression.With the technical feasibility，the platform could be helpful for the clinical gene diagnosis and provide guidance for CML treatment.

［Key words］chronic myeloid leukemia;BCR-ABL;standard reference;RQ-PCR;diagnosis platform

R446.9

A

1671-7295(2014)01-0013-05

黃丹，高貝貝，李莉，等.慢性粒細胞白血病BCR-ABL融合基因實時定量檢測平臺的建立［J］.大連醫(yī)科大學學報，2014，36(1):13 -17.

10.11724/jdmu.2014.01.04

大連醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院青年基金(2011)

黃 丹(1986-)，女，遼寧大連人，技師。E-mail:huangdan860901@126.com

康志杰，主治醫(yī)師。E-mail:cathie1997@sina.com

2013-09-08;

2013-11-30)